Аннотация:Аннотация Разработан биолюминесцентный метод АТР-метрии для быстрой количественной оценки микробной контаминации проб из воздушной среды и смывов с поверхностей по содержанию внутриклеточного АТРмикр с использованием универсального набора реагентов на основе термостабильной люциферазы светляков. Показана высокая корреляция между содержанием АТРмикр и количеством живых микроорганизмов. Ключевые слова Биолюминесценция, термостабильная люцифераза светляков L. mingrelica, АТР, микробная контаминация поверхностей, общее микробное число воздуха. Введение Микробное загрязнение закрытых помещений - основная причина распространения бактериальных и вирусных заболеваний, передающихся воздушно-капельным путем. В состав микробного сообщества входят бактерии (до 70%), включая патогенные, эукариоты, в том числе грибы (до 30%), а также вирусы и археи. Микробные загрязнители могут существовать на поверхностях, в виде взвешенных клеток или биоаэрозолей. Высокая контаминация объекта микроорганизмами требует быстрого реагирования и принятия соответствующих мер по обеззараживанию помещений. Чувствительным биоиндикатором живых клеток является АТР. Биолюминесцентная АТР-метрия на основе системы люциферин-люциферазной системы светляков – быстрый удобный метод детекции микробных загрязнений в режиме реального времени. Различные фирмы-производители предлагают простые тест-системы (Hygiena, Biotrace, HY-LiTEТМ и пр.) для определения чистоты поверхностей по содержанию общего АТРобщ, который складывается из внутриклеточного АТРмикр из живых клеток и остаточного содержания внеклеточного АТРвнеклет из разрушенных клеток. Этот качественный метод (в режиме чисто-грязно) удобен при проведения санитарного контроля, однако не дает реальной картины микробной контаминации образца - существует низкая корреляция между результатами микробиологических тестов и биолюминесцентного анализа. Цель данной работы- разработка универсального метода определения микробной контаминации воздушной среды и поверхностей по содержанию АТРмикр. Материалы и методы; результаты Дифференцированное определение общего АТРобщ (в лизированной суспензии) и внеклеточного АТРвнеклет (в клеточной суспензии) позволяет рассчитать содержание микроб-ного [АТР]микр. по разности [АТР]общ. и [АТР]внеклет. Анализ образцов смывов с поверхностей (n = 30) показал, что уровень [АТР]внеклет су-щественно превышал уровень [АТР]микр (от 10 до 470 раз). Содержание [АТР]микр варьирова-ло в пределах от 0,0003 до 0,12, а [АТР]внеклет – от 0,3 до 7,5 пмоль/мл смыва. Общее содер-жание живых микроорганизмов, определенное микробиологическим методом, составляло от 0 до 30000 КОЕ/мл, причем содержание грибов и плесени варьировалось от 0 до 500 КОЕ/мл. Показано, что концентрация микробного [АТР]микр коррелирует с классическим микробио-логическим методом (R=0,92) и позволяет выявить потенциально опасные живые микроорганизмы. Определение общего микробного числа (ОМЧ) в воздушной среде существенно осложнен более низким содержанием микроорганизмов, их сниженной метаболической активностью и сложностью проведения пробоотбора живых клеток. Мы оснастили портативный микробиологический импактор воздуха ПУ-1Б (Россия, аналог модели SAS) с высокой пропускной способностью влажным стерильным фильтром для эффективного накопления микроорганизмов из воздуха и сохранения их жизнеспособности и оптимизировали стадию пробоотбора (объем пробы 100 - 1000 л, скорость потока 200 л/мин). Мы рассчитали и показали на модельных культурах, что биолюминесцентный сигнал будет детектироваться в пробах без дополнительных манипуляций, если ОМЧ воздуха ≥ 103 КОЕ/м3. При более низ-ком содержании ОМЧ необходима предынкубация образцов в питательной среде до начала лог-фазы роста клеток. Оптимизация состава неселективной питательной среды и условий культивирования позволила сократить протяженность лаг-фазы и момента появления детек-тируемого сигнала до 3,7 ч при исходной контаминации воздушной среды 30 ± 4 КОЕ/m3. Показана применимость метода для анализа воздуха с различным уровнем микробной загрязненности (15 до 70 КОЕ/м3) с хорошей корреляцией между микробиологическим и биолюминесцентным АТР-анализом и предложены полуколичественные критерии оценки ОМЧ воздуха. Разработанная методика применима для определения ОМЧ воздуха в чистых помещениях и позволяет сократить время анализа с 24 до 3-5 ч. Заключение Разработана универсальная биолюминесцентная тест-система для быстрого определения микробной контаминации различных объектов и показана хорошая корреляция с микробиологическим и анализом. Работа выполнена в рамках государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова (тема № 121041500039-8).
