Биотестирование с использованием спектроскопии внутреннего отражения и биоиндикация

Саванина, Я.В.; Барский, Е.Л.; Фомина, И.А.; Лобакова, Е.С.

Авторы: Саванина Я.В., Барский Е.Л., Фомина И.А., Лобакова Е.С.
Сборник: Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: материалы международной конференции IT+M&Ec'2017
Год издания: 2017
Первая страница: 105
Последняя страница: 113
Аннотация: УДК 581.192.546 БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕКТРОСКО- ПИИ ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ И БИОИНДИКАЦИЯ Янина Вячеславовна Саванина, канд. биол. наук, ст. науч. сотр, e-mail: v.savanin@gmail.com, Евгений Львович Барский, канд. биол. наук, вед. науч. сотр., e-mail: gene_b@mail.ru, Ирина Алексеевна Фомина, соискатель, e-mail: irinafomina.net@mail.ru, Елена Сергеевна Лобакова, д-р биол. наук, проф., e-mail: elena.lobakova@gmail.com, Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В .Ломоносова, http://www.bio.msu.ru Рассмотрены два подхода, позволяющие проводить мониторинг загрязнений водо- токов: биоиндикация с использованием фитопланктонного сообщества водоемов и био- тестирование с использованием диализной культуры цианобактерий. Второй метод осно- ван на измерении разности дихроичных отношений полос поглощения белков клеток и их внешних структур (показатель ΔР), регистрируемых посредством ИК-спектроскопии внутреннего отражения. Ключевые слова: цианобактерии, микроводоросли, диализное культивирование, водная токсикология, биотестирование, биодиагностика, спектроскопия внутреннего отражения. ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ 106 Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017 Весенняя сессия Водотоки (реки, ручьи, каналы) представляют собой объекты, характеризую- щиеся высокой степенью пространственной и временной неоднородности как по гидролого-гидрохимическим характеристикам, так и по гидробиологическим пара- метрам. Для точной и своевременной оценки качества воды водоемов и водотоков, определения степени ее загрязнения необходимо дополнить нормативы ПДК (пре- дельно допустимые концентрации в среде некоторого набора веществ) - биологиче- скими методами. Основными направлениями биологического контроля загрязнений окружаю- щей среды являются: 1) биоиндикация последствий уже состоявшегося загрязнения водного объекта по функциональным и морфологическим показателям его обита- телей или по видовым характеристикам сообщества и 2) биотестирование как оценка качества окружающей среды по реакциям или характеристикам организ- мов, находящихся в этой среде, обычно - в кратковременных испытаниях [1]. В настоящей работе сравниваются два подхода: биотестирование, сочетаю- щее регистрацию изменений пространственно-временных параметров клеток и их внешних структур посредством ИК-спектроскопии внутреннего отражения с ис- пользованием диализных культур цианобактерий [2, 3] и биоиндикация с использо- ванием автохтонного фитопланктонного сообщества водоемов [4]. Материалы и методы. В качестве тест-объекта использовали культуру одно- клеточной цианобактерии Synechococсus sp. PCC 6301 (далее в тексте Synechococcus 6301). Для токсикологических опытов использовали 9-11 суточную диализную культуру цианобактерии, инкубируемую в мешках фирмы Serva как описано ра- нее [2, 3]. На основании экспериментальных данных, предоставленных МГУП «Мосводоканал», были выбраны 2 точки на реке Москва: у села Каринское выше г. Звенигорода (т. Каринское) и ниже г. Дмитрова (т. Дмитровское). Пробы отбирали ежемесячно в течение 2012 г. в соответствии с общепринятыми методами [5]. Состояние клеток цианобактерии-биоиндикатора оценивали по величине раз- ности дихроичных отношений полос поглощения белков целых клеток цианобакте- рий и их внешних структур (ΔР) при использовании метода спектроскопии внут- реннего отражения в ИК диапазоне. Уменьшение величины ΔР, как было показано для ряда микрооорганизмов, коррелирует со снижением их физиологической активности [2, 3]. Для исследования влияния на показатель ΔР уровня загрязненности водной среды использовался дисперсионный анализ. Для проверки выполнения предполо- жений ANOVA о нормальности распределения ΔР использовался критерий Колмо- горова-Смирнова. Необходимо отметить, что для всех рассматриваемых моделей дисперсионного анализа гипотеза о нормальности распределения ΔP не отвергается на уровне значимости α=0.05. Чтобы выявить, при каких значениях рассматривае- мых факторов значение ΔР можно считать максимальным (минимальным), исполь- зовался метод множественного сравнения средних – критерий Дункана [6, 7]. Результаты. Пробы поверхностных вод из точек Каринское и Дмитровское исследовали в лабораторных условиях при 20о С, и круглосуточное освещение (1500 лк) в течение года. Величина показателя ΔР популяции клеток Synechococcus 6301 для т. Каринское в ноябре - декабре в 1,5-2 раза, а в период с марта по июнь - в 1,5-3 раза выше по сравнению с таковым для точки Дмитровское (Рис. 1). Использование методов статистического анализа [6, 7] при оценке влияния уровня загрязненности водотоков на показатель ΔP позволяет уменьшить влияние неоднородностей условий, при которых проводятся отдельные наблюдения и полу- чить достоверный результат при минимальном количестве исследуемых проб (120 измерений в течение года). При статистической обработке данных для проверки ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017. Весенняя сессия 107 гипотезы о нормальности распределения ΔP использовали критерий согласия Кол- могорова-Смирнова. Для каждой из выборок p>0,20>α=0,05, т.е. гипотеза о нор- мальности распределения не отвергается, поэтому для исследования влияния на показатель ΔP каждого из факторов использовали двухфакторный дисперсионный анализ. Влияние факторов месяц и место взятия пробы, а также влияние взаимо- действия факторов на ΔP статистически значимо при p<<α=0,05. Результаты множественного сравнения (метод Дункана) также показывают, что время и место взятия проб и взаимодействие этих факторов влияют на ΔP, p -значение <0,05. Средние значения показателя ΔP в мае, июне, июле для т. Каринское и в июле для т. Дмитровское статистически значимо отличаются друг от друга и от всех других средних значений ΔP. Максимальное выборочное среднее ΔP наблюдается в июне в т. Каринское ΔP =0,376. Т.е. при равных условиях величина ΔР зависит, главным образом, от загрязненности водной среды. На показатель ΔР могут влиять как абиотические (загрязнения, температура, освещенность), так и биотические факторы среды (изменения биомассы, суммар- ной численности клеток и соотношения видов в фитопланктоне). Для выяснения влияния на показатель ΔР биотического фактора провели сопоставление результа- тов исследований с данными по количественному и видовому составу сообществ фитопланктона из мест отбора проб (Рис. 2), а также с результатами лабораторных исследований “первичных” показателей структуры сообщества фитопланктонных организмов (суммарной численности особей, биомассы), находящихся во внешнем объеме диализной культуры (Рис. 3). При использовании естественных сообществ микроводорослей в качестве биоиндикатора одним из аспектов, осложняющих правильность оценки, является высокая степень пространственной и временной изменчивости структурных характеристик (численность, биомасса, видовое разно- образие) фитопланктонного сообщества. Поэтому необходимо предварительное изучение особенностей естественной изменчивости фитопланктона в реках, уста- новление степени влияния на изменение структуры фитопланктона гидролого- гидрохимических факторов [4, 8]. Продолжительность опыта существенно превы- шала среднее время генерации для массовых форм микроводорослей в исследуе- мом водоеме, что позволяло оценить влияние, оказываемое тем или иным фактором на изменения численности и состава микроводорослей. В течение безледного сезона в водоемах наблюдается последовательная сме- на основных альгологических комплексов [8]. Наиболее широко в пробах фито- планктона из т. Каринское и т. Дмитровское представлены диатомовые и зеленые микроводоросли (Рис. 2 В, Г), а также цианобактерии (Рис. 2 Б). Весенне-летнее увеличение общей численности фитопланктона начинается в апреле и достигает максимума в мае на фоне максимального содержания питательных веществ, свя- занного с поверхностным смывом. При сравнении численности и видового состава массовых групп микроводорослей была обнаружена более выраженная весенняя и осенняя вспышки общей численности клеток фитопланктонных организмов для т. Каринское по сравнению с таковыми для т. Дмитровское (Рис. 2 А). При этом рост численности диатомовых микроводорослей наблюдается глав- ным образом в апреле и мае, в дальнейшем их численность снижается (Рис. 2, Б), а численность зеленых микроводорослей нарастает с мая по июль (Рис. 2, В). Из- вестно, что в период наиболее интенсивного нарастания биомассы фитопланктона в мае происходит весенняя вспышка зоопланктона [8], в результате к июню общая численность фитопланктона снижается. Уже небольшое снижение биомассы фито- планктона приводит к снижению пищевой конкуренции. В этот период (минимум конкуренции) происходит повышение относительной роли крупных форм фито- планктонных организмов. Нарастающий фитопланктон поглощает значительную часть загрязнителей в ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ 108 Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017 Весенняя сессия водоеме. Начиная с июня наблюдается интенсивная сукцессия фитопланктона, связанная с «температурным скачком» в поверхностном горизонте. Летняя сукцес- сия сопровождается ослаблением конкурентных отношений, вероятно, за счет преемственности: результат изменения биотопа вследствие развития популяций одного вида благоприятен для развития последующих видов. Далее устанавливает- ся сбалансированная система с примерно постоянной биомассой и относительным обилием видов сообщества микроводорослей, конкурирующих за пищевые ресур- сы. Взаиморегуляция численности в данный период приводит к вытеснению круп- ных форм более мелкими, что хорошо иллюстрируется при сравнении кривых чис- ленности и биомассы (Рис. 3). С августа начинается снижение суммарной солнеч- ной радиации и падение температуры в водоеме, приводящее к снижению числен- ности фитопланктона. В сентябре-октябре наблюдается повторное увеличение суммарной численности фитопланктона, главным образом за счет зеленых микро- водорослей и цианобактерий (Рис. 2 Б, В). В Таблице приведены данные по видовому составу и основным группам микроводорослей для т. Каринское и т. Дмитровское в апреле и мае. Рассмотрим наиболее часто встречающиеся в точках отбора проб виды фитопланктоных орга- низмов в течение года. В т. Каринское среднее содержание диатомовых микрово- дорослей в апреле достигает 12,1 тыс кл/мл, наиболее массовые виды Stephanodiscus – до 17, 6 тыс. кл/мл (из общего количества 19,2 тыс на 12.05. 2011) и Fragilaria capucina (до 1080 кл/мл), а также представители рода Navicula (11 видов, наиболее массовые из них N. cryptocephala – 132 кл/мл и N. gracilis –52 кл/мл, а также р. Nitzschia. Численность зеленых микроводорослей нарастает с мая по июль (Рис. 13 Г). В апреле наиболее массовыми видами являются Chlamydomonas oblonga, C. anurea, а также Monoraphidium arcuatum. В мае наиболее распростра- ненными видами являются Monoraphidium minutum (216 кл/мл), р. Scenedesmus (в том числе S. bijugatus –192 кл/мл и S. quadricauda – 96 кл/мл) и мелкие хлорокок- ковые (до 120 кл/мл). Chlamydomonas monadina присутствует в количестве 24 кл/мл, но при этом объем его клеток составляет 4468 мкм3. Для сравнения объем M. arcuatum – 52 мкм3. В июне при общем количестве фитопланктона 4200 кл/мл количество диато- мовых микроводорослей составляет не более нескольких десятков кл/мл, а зеленых – до 4 тыс. кл/мл. Наиболее представлены мелкие виды: Oocystis lacustris – 504 кл/мл (100мкм3), Scenedesmus quadricauda – 480-648 кл/мл (152 мкм3), M. arcuatum (300 кл/мл), Didymocystis inermis - 192 кл/мл (40 мкм3), Coelastrum microporum - 168 кл/мл (92 мкм3) и относительно крупные Chlamydomonas anurea – 108 кл/мл (639 мкм3). В июле максимальное количество зеленых микроводорослей – 5700 кл/мл. Наиболее массовые виды O. lacustris – 1224 кл/мл, C. microporum – до 1152 кл/мл, Chlamydomonas anurea – 864 кл/мл, р. Scenedesmus (суммарно) – более 1200 кл/мл, в том числе S. quadricauda – до 756 кл/мл. В августе суммарное количество зеленых микроводорослей снижается до 4600 кл/мл. Наиболее массовые виды: O. lacustris –1872 кл/мл, р.Crucigeniella (суммарно) – более 1500 кл/мл, в том числе Crucigeniella apiculate – 1008 кл/мл, M. arcuatum – 756 кл/мл, р. Scenedesmus – бо- лее 1200 кл/мл, в том числе S. quadricauda – до 1152 кл/мл, Chlamydomonas anurea – до 504 кл/мл. Количество цианобактерий в весенне летний период составляет не более де- сятков кл/мл, основными видами являются Anabaena flos-aquae (320 мкм3) и Aphanizomenon flos-aquae (78 мкм3). В сентябре количество Aphanizomenon flosaquae достигает 11232 кл/мл, Anabaena flos-aquae – 2304 кл/мл, а также Gomphosphaeria lacustris – 744 кл/мл (26 мкм3), Microcystis pulverea – 276 кл/мл (5,6 мкм3), появляется Oscillatoria limosa. В октябре количество Aphanizomenon flos-aquae снижается до 6480 кл/мл, Microcystis aeruginosa – 336 кл/мл, количество представи- ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017. Весенняя сессия 109 телей р.Oscillatoria возрастает до 200 кл/мл. В ноябре количество Aphanizomenon flos-aquae составляет в среднем 333 кл/мл, встречается Oscillatoria и Gomosphaera lacustris – по 24 кл/мл. В зимние месяцы число представителей этих видов состав- ляет также не более нескольких десятков кл/мл. Для т. Дмитровское «весенняя» вспышка суммарной численности фитопланк- тонных организмов смещена к июню. Преобладающими группами являются диа- томовые: в мае в среднем 29000 кл/мл против 12100 в т. Каринское, и зеленые мик- роводоросли: в мае и июне соответственно 4100 и 3800 кл/мл против 1200 и 4200 кл/мл. в т. Каринское. В сентябре-октябре наблюдается повторное увеличение суммарной численности фитопланктона, главным образом за счет зеленых водо- рослей: 3900 кл/мл против 1300 в т. Каринское, и цианобактерий: 11500 кл/мл про- тив 5300 в т. Каринское. Максимальные различия отмечены в одной из октябрьских проб – 45000 кл/мл в т. Дмитровское против 5000 кл/мл в т. Каринское. Рассмотрим подробнее по группам. В мае наиболее массовыми представите- лями диатомовых являются Stephanodiscus – 7100 кл/ мл, р. Fragilaria (в том числе F. crotonensis и F. intermedia – по 108 кл/мл), р. Navicula и р. Nitzschia - десятки клеток/мл). В июне в большей степени представлены крупные диатомовые – р. Navicula (по нескольку десятков представителей 11 видов, объем клеток до 695-6382 мкм3), р.Nitzschia (5 видов, в том числе N. acicularis – 882 кл/мл). Численность зе- леных микроводорослей нарастает с июня. Равномерно, в среднем по 200–500 кл/мл представлены р. Chlamydomonas: C. oblonga, С. anurea – 432 кл/мл, С. monadina – 54 кл/мл (4368 мкм3), а также Didimocystis lineata, Dicthyosphaerium ehrenbergian – 504 кл/мл, Coelastrum microporum –до 576 кл/мл, р. Scenedesmus – бо- лее 1000 кл/мл, в том числе S. quadricauda C – 684 кл/мл, S. bigugatus, Tetrastrum triangulare – 396 кл/мл, Oocystis lacustris – 216 кл/мл. Цианобактерии в июле представлены Merismopedia elegans – 192 кл/мл (90 мкм3), Aphanizomenon flos-aquae – 48 кл/мл. В сентябре количество A. flos-aquae возрастает до 5320 кл/мл. Представлены также Oscillatoria limnetica – 774 кл/мл, Coelosphaerium dubium, Microcystis aeruginosa и Anabaena flos-aquae в количестве десятков кл/мл. В октябре количество Aphanizomenon flos-aquae возрастает до 41280 кл/мл, далее снижается до17550 кл/мл, затем до 6912 кл/мл. В лабораторных экспериментах (непрерывное освещение 100 Вт/м2, 20-250) начиная со 2-х сут. во «внешнем» объеме тест-культуры Synechococus 6301 (вне диализного мешка) наблюдался интенсивный рост фитопланктона, в том числе в «зимних» пробах воды. Пробы «внешнего» планктона оценивались микроскопиче- ски – по составу (определение до рода), общему числу клеток, а также по показа- телю ΔР. Ввиду высокого разнообразия видов (Таблица), для правильного подбора измерительных элементов пробы фитопланктона на этапе подготовки разделяли на 2 класса: при 2 тыс. g осаждались крупные клетки диатомовых, зеленых микрово- дорослей и нитчатых цианобактерий, при 6 тыс. g – в основном мелкие цианобак- терии. Значения показателя ΔР, измеренные в «легкой» фракции фитопланктона, нарастающего во внешнем объеме культиватора, представлены на Рис. 4. Полу- ченные результаты достаточно близки к результатам годичного эксперимента с тест-культурой Synechococсus 6301 (Рис.1), на этом основании в дальнейшем изу- чалась возможность использования в качестве тест-культур фототрофных микро- организмов, которые отличаются от Synechococсus 6301 по размерам, строению клеточной стенки, другим внешним структурам клетки, а также по физиологии [3]. Обсуждение результатов. Система экологического контроля на всей терри- тории России основана на дифференцированном определении концентрации вред- ных веществ и сопоставлении их с ПДК. С учетом того, что: 1) не более 10 % от общего числа нормированных вредных веществ обеспечено методами анализа на ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ 110 Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017 Весенняя сессия уровне ПДК; 2) изолированное действие загрязняющих веществ возможно только в лабораторных условиях, в экосистемах наблюдается взаимодействие и превраще- ние загрязняющих веществ в экосистемах; 3) помимо химического загрязнения оказывают влияние и многие другие антропогенные факторы, например, электро- магнитное, тепловое и биологическое загрязнение и т.д., возникает необходимость дополнить методологию ПДК биологическими методами. Основными из них явля- ются биотестирование и биоиндикация. Живые организмы способны воспринимать более низкие концентрации веществ, чем любой аналитический датчик. Биотестированием обычно называют метод оценки качества окружающей среды по реакциям или характеристикам организмов, находящихся в этой среде, обычно - в кратковременных испытаниях. Обнаруженный при биотестировании эффект однозначно сигнализирует о присутствии вредоносного фактора, но отсут- ствие эффекта еще не гарантирует безвредности пробы. Кроме того, внедренные в практику методы токсикологического контроля, из-за их кратковременности, не позволяют оценивать более поздние эффекты загрязнения. Биоиндикация предусматривает выявление уже состоявшегося или происхо- дящего загрязнения водоема по функциональным характеристикам его обитателей и экологическим характеристикам сообществ организмов. видовой состав гидро- бионтов из загрязняемого водоема служит итоговой характеристикой токсикологи- ческих свойств водной среды за некоторый промежуток времени и не дает ее оцен- ки на момент исследования. А в холодное время года системы биологической ин- дикации вообще не могут быть применены. Как нам представляется, предлагаемые в данной статье методические подхо- ды позволят снизить влияние указанных особенностей осложняющих правильность оценки качества вод в речных системах. Водные растительные сообщества и, в особенности, фитопланктон, в настоящее время широко применяются как в биоте- стировании, так и в биодиагностике. Культуры микроводорослей и цианобактерий. включая Synechococcus 6301 отвечают таким важным для биоиндикатора требова- ниям как: 1) распространенность в природе (космополитизм многих видов); 2) они часто являются центрами формирования природных водных сообществ (организ- мы-эдификаторы); 3) высокая чувствительность к воздействию широкого круга токсикантов. Последнее объясняется мелкими размерами клеток, обеспечивающи- ми высокое соотношение поверхность/объем, а также выраженной зависимостью физиолого-биохимических ответов клеток на действующие физико-химические факторы среды (обмен веществ между клеткой микроорганизма и средой осу- ществляется всей ее поверхностью). Для контроля загрязнения природного водоема (тем более – водотока) in situ необходима иммобилизация клеток. Одной из разновидностей иммобилизованных культур является диффузионное (далее в тексте – диализное) культивирование. Тест-культура отделена от внешнего объема среды мембраной с размерами пор, пропускающих соединения с определенной молекулярной массой. Полученная си- стема представляет упрощенную модель функционирования природной биопленки цианобактерий, т.е. биологического сообщества: во внутреннем объеме мешка накапливаются высокомолекулярные полисахариды, которые объединяют отдель- ные клетки и создают вокруг них специфические условия – организмы развивают- ся не в водно-солевой среде, а в коллоидном матриксе, опосредующем воздействия внешней среды на организм. Диализная мембрана не препятствует выведению низ- комолекулярных продуктов метаболизма, ингибирующих клеточное деление, и по- ступлению нового субстрата из «внешней среды». Как следствие, в относительно небольшом объеме диализного мешка накапливается высокой плотности популя- ция «физиологически молодых», чувствительных к внешним воздействиям клеток. ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017. Весенняя сессия 111 Клетки в диализном мешке остаются в стерильных условиях, при этом культуру в диализном мешке легко перемещать из одной среды в другую. На минимальных средах это позволяет обеспечивать истощение клеточных резервов для увеличения чувствительности культур при одновременном удалении продуктов автоингибиро-вания, кроме того, возможно изучать изменения тест-параметров культур в любых загрязненных средах, включая естественные водоемы, а также моделировать как разовый, так и постоянный сброс различных загрязнителей путем замены внешней среды и изучать воздействие повреждающих факторов в различных сочетаниях. Стандартные измеряемые параметры культур микроводорослей, чувствитель- ные к условиям культивирования, включают (по Shubert, 1984) [1]: число и объем клеток, биомассу, содержание хлорофилла, активность фотосинтеза с оценкой по сумме ответа всех показателей. Указанные параметры в значительной степени за- висят от концентрации токсиканта в клетке и продолжительности его воздействия, т.е. как от абиотических факторов (состав среды, наличие других токсикантов), так и от состояния самой тест-культуры (начальная плотность тест-культуры и фаза формирования популяции). Для стандартизации физиологических ответов клеток мы использовали качестве тест-объекта для токсикологических исследований диализную культуру Synechococсus 6301 в возрасте 9-11 сут. при ее переходе в стационарную фазу роста. В данном интервале величина показателя ΔP диализной культуры за период 2-5 сут практически не изменяется, рост культуры, а также изменения окислительно-восстановительного потенциала и рН среды минимальны, а клетки сохраняют чувствительность к внешним воздействиям и физиологическую активность [2. 3]. При измерениях в поляризованном свете в области 1660 см-1 и 1550 см-1, принадлежащей белковым компонентам, наблюдали наиболее существенные различия между клетками в разных функциональных состояниях, а также между целой клеткой (Ркл) и ее поверхностными структурами (Рвн.ст.). Разность между Ркл и Рвн.ст, обозначенная нами как показатель ΔР, для диализных культур зависит главным образом от степени загрязнения исследуемой водной среды, но не от начальной концентрации клеток тест-культуры, времени инкубации культуры на загрязненной среде и объема исследуемой среды [9]. Биоиндикация наряду с пока- зателем ΔР основана на изучении в отобранных из т. Каринское и т. Дмитровское пробах воды в течение года особенностей естественной из- менчивости фитопланктонного со- общества (численность, биомасса, видовое разнообразие). При этом был выявлен ряд закономерностей. Так, при сравнении видового соста- ва фитопланктона можно заметить, что в более загрязненной среде пре- обладают более крупные клетки с толстой клеточной стенкой (Chlamydomonas), кремниевым панцирем (Stephanodiscus, Navicula), слизистым чехлом (Aphanizomenon). У более крупных клеток меньшее соотношение поверхность: объем, при котором снижается доза загрязнителя, поглощаемого клеткой, клеточные покровы также связывают определенное количество загрязнителей, т.е. такие клетки менее Рис. 1. Динамика показателя ΔP, полученная в го- дичном эксперименте с использованием диализной культуры цианобактерий Synechococus 6301. ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ 112 Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017 Весенняя сессия чувствительны к загрязнениям [4, 8]. Наименьшие значения показателя ΔР в годичном эксперименте наблюдали с декабря по апрель, и хотя загрязнители в это время накапливаются, главным обра- зом, в придонной части водоема, а пробы отбирали в поверхностном слое, в этот период минимально и количество фитопланктона, поглощающего значительную часть загрязнителей в водоеме. Максимальные значения показателя ΔР для обеих точек отбора проб наблюдаются с мая по июль, можно предположить, что это свя- зано с весенне - летним увеличением численности фитопланктона. В т. Каринское биомасса фитопланктона в июне в 6,5 раз меньше, чем в мае, а суммарное число клеток – в 3 раза ниже. В т. Дмитровское в те же месяцы биомасса фитопланктона с мая по июль снижается в 10 раз, а суммарное число клеток – снижается в 5,5 раза. Таким образом, высокие значения показателя ΔР для июльской пробы в т. Дмит- ровское не могут быть объяснены только интенсивным нарастанием биомассы фитопланктона. Пробы фитопланктона, нараста- ющего во внешнем объеме диализной культуры, близки по составу микроор- ганизмов к перечню, определенному для фитопланктона из мест отбора проб (Рис. 2), но заметно отличаются по соотношению групп микроводо- рослей. Преобладает «легкая» фрак- ция – клетки, которые осаждаются при 6 тыс. g. Скорее всего, это связано с увеличением в данной фракции доли r-стратегов с высокой скоростью ро- ста. Мелкие растущие клетки более чувствительны к внешним воздействиям. Рис. 2. Биоразнообразие фитопланктона в про- бах речной воды, отбираемых в двух точках на р. Москва в течение года (А - общее количе- ство, основные группы – диатомовые (Б) и зе- леные водоросли (В), цианобактерии (Г). Рис. 3. Биомасса (А) и число клеток фито- планктона в пробах воды из р. Москва (внешний объем диализной культуры). Ряд 1 – т. Каринское, ряд 2 – т. Дмитровское; по оси Х- месяцы 2012 г. Рис. 4. Значения ΔР для фитопланктона, нараста- ющего во внешнем объеме диализной культуры ПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017. Весенняя сессия 113 Авторы полагают, что в работе новыми являются следующие положения и результаты: Метод биотестирования с использованием диализной культуры цианобакте- рий, основаный на измерении разности дихроичных отношений полос поглощения белков клеток цианобактерий и их внешних структур (показатель ΔР), регистриру- емых посредством ИК-спектроскопии внутреннего отражения, может использо- ваться в мониторинге загрязнений водоемов, включая водотоки. Использование методов статистического анализа при оценке влияния уровня загрязненности водотоков на показатель ΔP позволяет уменьшить влияние неодно- родностей условий, при которых проводятся отдельные наблюдения и получить достоверный результат при минимальном количестве исследуемых проб. Методика с использованием диализной аксеничной культуры цианобактерий может быть применима не только в биотестировании но и в биоиндикации. Сопо- ставление биотестирования с использованием показателя ΔР с методом биоиндика- ции с использованием автохтонного фитопланктонного сообщества исследуемого водоема дает основание использовать этот подход для разработки перспективных методов экологического контроля. Таблица Массовые виды фитопланктонных организмов в точках отбора проб. Фитопланк- тонные орга- низмы т. Дмитровское т. Каринское Апрель Май Апрель Май Общая чис- ленность, кл/мл 2175 926 7500 14378 Диатомовые микроводо- росли 1813 29754 12065 12496 Зеленые мик- роводоросли 309 4145 1164 4163 Цианобакте- рии 102 168 282 132 Массовые ви- ды Diatoma elongatum D. vulgare Fragilaria Navicula cryptocephala . N. gastrum N. gracilis N. hungarica Nitzschia gracilis N. linearis N. palea Stephanodiscus Chlamydomonas oblonga C. anurea Monoraphidium arcuatum Fragilaria crotonensis F. intermedia Navicula cryptocephala N. gracilis Nitzschia acicularis N. holsatica N. palea N. hungarica Stephanodiscus Chlamydomonas monadina Scenedesmus quadricauda Aphanizomenon flos-aquae Diatoma elongatum D. vulgare F. crotonensis N. cryptocephala N. gastrum N. gracilis N. viridula . Nitzschia gracilis N. palea Stephanodiscus Chlamydomonas anurea C. oblonga Scenedesmus bigugatus S. quadricauda Monoraphidium arcuatum. Diatoma elongatum F. crotonensis N. cryptocephala N. gracilis N. lacustris Nitzschia forticola N. gracilis N. palea N. vermicularis Stephanodiscus Chlamydomonas monadina C. oblonga Scenedesmus bigugatus S. quadricauda Anabaena flosaquae Monoraphidium minutum Литература 1. Булгаков Н.Г. 2002. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды. Обзор существующих подходов // Успехи современной био- логии. М.: Наука, Т. 122. № 2. С. 115-135. 2. Lebedeva A.F., Barsky E.L., Savanina Ya V., Koroleva S.Yu, Korolev Yu N., LobakoПРОБЛЕМЫ, МЕТОДЫ И ПРОДУКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ 114 Информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии: труды межд. конф. IT + M&Ec`2017 (Гурзуф, 02.06–12.06.2017 г) / под. ред. проф. Е.Л. Глориозова. М.: ИНИТ, 2017 Весенняя сессия va E.S. Dialysis cultivation of microorganisms as the appropriate model of population control in ecosystem research. Moscow University biological sciences bulletin, и Allerton Press (New York, N.Y., United States), 2010. Vol 65. № 2. Р. 56-60. 3. Барский Е.Л., Саванина Я.В., Фомина И.А., Лобакова Е.С. 2015. Оценка качества водной среды с использованием цианобактерий. Материалы XXIV Международн. конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». М.: ООО «Новые информационные технологии». С. 224-233. 4. Ростанец Д.В., Хазанова К.П., Хромов В.М. 2013. Проблемы использования фи- топланктона в гидробиологическом мониторинге рек высокоурбанизированных террито- рий (на примере реки Москвы) // Известия Самарского научного центра РАН, Самара: Изд- во ФГБУН: «Самарский научный центр РАН». Т. 15. № 3 (2). С. 677-684. 5. Шлычкова В.В., Брызгало В.А., Хоружая Т.А., Назарова А.А. 1992. Организация и проведение режимных наблюдений за загрязнением поверхностных вод суши на сети Роскомгидромета. Методические указания. Охрана природы. Гидросфера. РД 52.24.309-92. СПб.: Гидрометеоиздат. 67 с. 6. Мятлев В.Д., Панченко Л.А., Ризниченко Г.Ю., Терехин А.Т. 2009. Теория веро- ятностей и математическая статистика. Математические модели. // Университетский учеб- ник. М.: "Академия". 315 с. 7. Zar J.H. 2010. Biostatistical Analysis, 5th Edition. Pearson Prentice-Hall, Upper Saddle River, NJ. 944 pp. 8. Федоров В.Д., Ильинский В.В., Капков В.И., Карташева Н.В., Лихачева Н.Е., Недосекин А.Г., Полякова А.В., Полякова Т.В., Хромов В.М., Чертопруд М.В. 2006. Практическая гидробиология. Пресноводные экосистемы: Учебник для студентов, обуча- ющихся по направлению 020200 «Биология», специальности «Биоэкология» и другим био- логическим специальностям. М.: ПИМ. 367 с. 9. Фомина И.А., Саванина Я.В., Барский Е.Л., Панченко Л.А. Лобакова Е.С. Метод ИК-спектроскопии внутреннего отражения клеток цианобактерий и их внешних структур для оценки уровня загрязнения водотоков // Проблемы региональной экологии. 2016. № 6. Bioassay using internal reflection spectroscopy and bioindication Yanina Vyacheslavovna Savanina, Cand. Biol. Sciences, art. Evgeniy L’vovich Barsky, Cand. Biol. In Science, Leading Researcher Irina Alekseevna Fomina, applicant Elena Sergeevna Lobakova, Dr. Biol. Sciences, prof. ResearcherConsidered two approaches that allow you to monitor the watercourses contaminations: bioindication using fitoplankton community of reservoirs and bioassay using dialysis culture of cyanobacteria. The second method is based on the measuring of the difference of dichroic absorption bands relationships of proteins in cells and their external structures (Δp) recorded by infrared spectroscopy internal reflection. Keywords: cyanobacteria, microalgas, dialysis cultivation, water toxicology, biodetection, biodiagnostics, IF-spectroscopy of internal reflection.
Добавил в систему: Лобакова Елена Сергеевна

	ИСТИНА	Войти в систему Регистрация
	ИСТИНА ИНХС РАН
	Главная Поиск Статистика О проекте Помощь

ИСТИНА

ИСТИНА ИНХС РАН

Биотестирование с использованием спектроскопии внутреннего отражения и биоиндикациястатья

Прикрепленные файлы