Нокаут генов в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека при помощи системы crispr/cas9 и отбор клонов при помощи различных методов скринингакнига
Аннотация:Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) человека являются удобным и перспективным ресурсом клеток, поскольку их можно дифференцировать практически во все типы стволовых и прогениторных клеток взрослого организма. Данное свойство можно использовать в различных областях регенеративной медицины и фундаментальной клеточной биологии. В связи с бурным развитием систем редактирования генома, а именно CRISPR/Cas9, стали актуальны методы нокаутирования различных генов в культурах клеток, в том числе и в ИПСК. Так, например, нокаут различных генов в ИПСК поможет выявить роль этих генов в процессах развития и дифференцировки. Однако, учитывая особенности культивирования ИПСК in vitro, например, обычно низкую эффективность трансфекции, крайне низкую способность к клонированию малым разведением, а также их свойство расти в плотных колониях, получение отдельных клонированных линий ИПСК с нужной мутацией представляет собой определенную проблему. Мы постарались суммировать несколько методов (электропорация, клеточный сортинг, скрининг клонов, в том числе при помощи цифровой капельной ПЦР) в один протокол получения линий ИПСК с нокаутированными генами.