ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Создание 3D (объемных) клеточных культур является на сегодняшний день одним из наиболее перспективных направлений выращивания искусственных клеток различной природы (сосудистых, нейронных), которые по своим свойствам максимально близки к клеткам живых организмов, и могут быть в дальнейшем использованы в трансплантации, для изучения ранних патологических изменений клеток в целях ранней диагностики и лечения социально-значимых заболеваний (болезней Альцгеймера, Паркинсона, когнитивных нарушений, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и пр.). На этом этапе наши исследования были направлены на создание твердофазных сенсорных нанокомпозитных материалов с направленно подобранным химическим дизайном микропористой полимерной поверхности (хитозана, альгината, желатина, коллагена), а также индикаторных систем, позволяющих визуализировать и определять маркеры нейромедиаторного обмена (допамин, адреналин и норадреналин) флуоресцентным методом для изучения функционирования нервных клеток, сигнальных путей в нейронах и высвобождения нейромедиаторов. Выбор полимерных матриц обусловлен тем, что они одновременно являются биосовместимыми культуральными средами для роста 3D (объемных)-клеточных структур. Для высокочувствительного (на уровне отдельных молекул) определения катехоламинов в биологических жидкостях были созданы новые индикаторные реакции на основе интенсивно флуоресцирующих соединений, повышающих устойчивость КА и их метаболитов в клеточных культуральных средах и других биообъектах. Одним из подходов, обеспечивающих создание высокочувствительных и селективных методик определения катехоламинов и их метаболитов, является получение их флуоресцирующих производных с ионами металлов. Поскольку для исследования важна не только экспрессность, но и представительность результатов при работе со сложными по составу объектами, то флуоресцентное определение вышеуказанных маркеров нейромедиаторного обмена (катехоламинов (КА) и их метаболитов) одновременно проводили в 96-луночном полистирольном планшете. Для определения КА нами использовано образование ими устойчивых комплексов с европием (Eu3+) и окситетрациклином (ОТЦ). Изучив протекание реакции в ряде биологических буферов (MOPS, MES, Tris, HEPES), оптимальным по воспроизводимости и интенсивности сигнала выбрали MOPS буферный раствор с рН 7.5. Оптимальным соотношением концентраций Eu:ОТЦ по интенсивности и воспроизводимости сигналов поглощения и флуоресценции оказалось 1 : 1. В результате изучения влияния на аналитический сигнал 4 неиногенных ПАВ (ТВИН 20, ТВИН 80, Бридж 35, Тритон Х-100), анионогенного (ДДС) и катионогенного (ЦТАБ) в диапазоне концентраций 10-4 – 10-2 М выяснили, что наиболее интенсивен сигнал флуоресценции при использовании ТВИН 80 с концентрацией 10-2 М. оптимальное время реакции составило 10 мин, λex = 416 нм, λem = 617 нм. В оптимальных условиях комплексообразования разработаны методики определения катехоламинов и их метаболитов в растворе. Подобный подход весьма перспективен, так как позволяет повысить интенсивность флуоресценции КА и их метаболитов в 200 – 400 раз по сравнению с собственной флуоресценцией этих молекул и батохромно смещает максимум спектра флуоресценции, что позволяет нивелировать мешающее влияние матриц биологических объектов. Предложенные методики позволяют определять КА и их метаболиты с чувствительностью вплоть до 50 фМ, что дает возможность использовать их для определения маркеров нейромедиаторного обмена в плазме крови и клетках, как здоровых людей, так и с нейродегенеративными и нейроэндокринными заболеваниями. Изучено возможное мешающее влияние матричных компонентов биологических жидкостей человека (мочевой кислоты, мочевины, креатинина, фенилананина, тирозина, триптофана, глюкозы) на результаты определения КА и их метаболитов. Оказалось, что ни один из матричных компонентов мочи и плазмы крови не оказывает мешающее влияние на определение КА. Полученные результаты выбора наиболее подходящей биосовместимой матрицы для иммобилизации комплекса Eu3+–ОТЦ при переходе от водной среды к 3D-полимерным структурам показали, что в матрице на основе хитозана комплекс Eu3+-ОТЦ стабилен в течение 36 дней, в последующие 2 месяца аналитический сигнал сохраняется, но начинает ухудшаться воспроизводимость последнего. Изучение этого факта требует проведения дополнительных исследований. Разработанные в матрице хитозана методики определения допамина (ДА), норадреналина (НА), адреналина (АД), ванилилминдальной (ВМК) и гомованилиновой (ГВК) кислот, серотонина, L-ДОФА позволили понизить пределы их обнаружения вплоть до 10-14 М, т.е. иммобилизация комплекса КА-Eu3+–ОТЦ позволила повысить чувствительность определения приблизительно в 40 раз, по сравнению с определением в растворе, упростить методики определения КА и их метаболитов, ускорить анализ, а также повысила стабильность комплекса во времени. Использование желатина для иммобилизации комплекса Eu3+–ОТЦ также позволяет повысить чувствительность определения перечисленных выше КА в 15 раз и улучшить метрологические характеристики методик по сравнению с их определением в растворе. В 3D-структуре на основе альгинатного геля удалось разработать методики определения только ДА, НА, ГВК, АД. В случаях других аналитов либо наблюдалось отсутствие линейной зависимости интенсивности флуоресценции от их концентрации, либо менялся угол наклона градуировочной зависимости. По результатам проведенного исследования наиболее подходящим полимером для создания 3D-структур был признан хитозан, так как при иммобилизации в нем комплекс Eu3+–ОТЦ стабилен более месяца, удается добиться увеличения чувствительности определения аналитов в 40 раз с лучшей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение не более 1.5 %). Вероятнее всего, это обусловлено структурой хитозана – линейное строение и наличие большого числа аминогрупп стабилизирует иммобилизованный комплекс и позволяет добиться высокой чувствительности и воспроизводимости при определении маркеров нейромедиаторного обмена. Были подобраны наиболее подходящие условия для формирования пленок всех перечисленных выше гидрогелей и тройного комплекса Eu3+–ОТЦ–КА в них: концентрация, состав и рН реконструирующего буферного раствора, соотношение объемов растворов геля, реконструирующего буферного раствора и компонентов реакции, порядок смешения, время и температура инкубирования геля с комплексом в планшете, и разработаны методики определения КА во всех гидрогелях Полученные результаты свидетельствуют о том, что наиболее подходящими матрицами для жизнедеятельности клеток в разработанных вариантах определения КА являются альгинатный и коллагеновый гидрогель. Это связано с тем, что желатиновый гель имеет очень плотную структуру, не слишком «комфортную» для благоприятного роста и жизнеспособности клеток, а альбуминовый гидрогель имеет в своем составе щелочь, и без промывки его использование для роста клеток также нежелательно. Разработанные подходы апробировали на примере определения ДА в клеточных культурах PC12 – опухолевых нейронах феохромоцитомы, выращиваемых в коллагеновом гидрогеле. Была изучена цитотоксичность компонентов индикаторной реакции на клетки PС12 с помощью флуориметрического метода «CellTiter-Blue® Cell Viability Assay (Promega)», основанного на использовании индикаторного красителя резазурина для измерения метаболической способности клеток. Жизнеспособные клетки сохраняют способность восстанавливать резазурин, имеющий очень слабую собственную флуоресценцию и максимум поглощения при λmax = 605 нм, до резоруфина, который сильно флуоресцирует при λex = 579 нм, λem = 584 нм и поглощает при λmax = 573 нм. Нежизнеспособные клетки быстро теряют метаболическую способность, как следствие, не восстанавливают индикаторный краситель и, таким образом, не генерируют флуоресцентный сигнал. Получаемая интенсивность флуоресценции пропорциональна числу жизнеспособных клеток. Показано, что в целом использование системы на основе комплекса Eu3+ – ОТЦ для определения ДА в этом типе клеточных структур возможно, так как жизнеспособность клеток сохраняется в течение 7 дней, а этого достаточно для отслеживания протекающих процессов в клеточной среде. Для повышения жизнеспособности клеток в течение более длительного времени разработали методику с использованием комбинации альгинатного и коллагенового гидрогелей – в альгинатном гидрогеле иммобилизовали комплекс Eu3+–ОТЦ, а в коллагеновый гидрогель поместили ДА (или нейроны, выделяющие ДА). В результате удалось добиться улучшения воспроизводимости определения ДА по сравнению с определением в коллагеновом гидрогеле на 1 % и снизить предел его обнаружения до 26 пМ (в альгинатном гидрогеле – 300 пМ, в коллагеновом гидрогеле – 60 пМ). Разработанная методика была проверена на цитотоксичность на нейронах РС12 и апробирована при определении допамина в их клеточной культуре. Методика определения АД была применена для анализа на его содержание раковых клеток кишечника человека (HCT116), а методика определения серотонина – для анализа нейронов из ганглий пиявок. Из литературы известно, что эти клетки выделяют только серотонин в концентрации 10-7 – 10-6 М. Таким образом, нами созданы новые сенсорные матрицы на основе полимерных структур (хитозана, альгината, желатина и коллагена) для визуализации и определения актуальных аналитов в живых клеточных культурах, адаптированные под серийно выпускаемое оптическое оборудование – флуоресцентные сканеры и конфокальные микроскопы. Предложенные полимерные матрицы являются одновременно и культуральной средой для роста 3D (объемных)-клеточных структур. Разработана твердофазная сенсорная система на основе тройного комплекса европий(III)-окситетрациклин-нейромедиатор/метаболит для визуализации и флуоресцентного определения маркеров нейромедиаторного обмена (допамина, адреналина, норадреналина и их метаболитов) непосредственно в упомянутых полимерных микропористых гелевых матрицах – модели роста нейронной сети. Предварительные результаты показали, что предложенная индикаторная система позволяет понизить ПО катехоламинов вплоть до 1 фМ. Благодаря высокой устойчивости полученных тройных комплексов и низкой цитоксичности их можно использовать для определения нейромедиаторов и их метаболитов в клеточных культурах без учета конкурирующих взаимодействий с матричными компонентами образцов. Помимо обсужденных исследований, нами были проделана работа по созданию индикаторных систем для контроля биоразложения матриц на основе природных полимеров (на примере коллагена) ex или in vivo. Такие индикаторные реакции необходимы для контроля ферментативного гидролиза полимера и поиска эффективных допантов (прежде всего ингибиторов или активаторов коллагеназы) в матрицу коллагена для ускорения или замедления его биоразложения в целях дальнейшего применения в биотехнологических процессах. Изучен процесс биодеградации коллагена в присутствии коллагеназы в условиях, характерных для воспалительных процессов в организме (t = 37 – 38 °C, pH = 4.5 – 6.5, присутствие избытка солей Ca2+). Одним из продуктов расщепления коллагена является L-гидроксипролин, который окисляется хлорамином Т до пиррола, образующего далее с п-диметил-аминобензальдегидом окрашенный комплекс. Количество последнего контролировали спектрофотометрически. Предложены механизм протекания каждой из стадий этого процесса и высказана гипотеза о строении промежуточных продуктов; подобраны оптимальные условия проведения индикаторной реакции для определения продуктов деградации до 1 мг/мл коллагена. Процесс расщепления коллагена был изучен на примере коммерчески доступной резорбируемой мембраны BioVin.