![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Целью данного исследования является экспериментальное изучение радиобиологических свойств клеточных культур глиобластом после облучения высокими разовыми дозами от 5 до 250Гр с оценкой уровня апоптоза и пролиферативной активности, а также количества и выраженности различных путей репарации двунитевых разрывов ДНК. За первый год проекта была изучена реакция клеточных культур на однократное облучение, построены кривые доза-эффект для перечисленных показателей. Для проведения экспериментального исследования были использованы клеточные культуры глиобластомы человека. Одна из культур клеток была получена из гистологического материала пациента, за 2 года до операции проходившего курс лучевой терапии (пациент Г.). Вторая культура была выращена из материала пациента с первичной опухолью, не подвергавшегося ранее лучевому воздействию (пациент С.). Полученные культуры отличаются от линейных культур тем, что не являются монокультурами, как в большинстве других исследований, а представляли из себя гетерогенные клеточные популяции, содержащие в том числе и стволовые клетки, что позволило приблизить эксперимент к облучению реальных опухолей. Для определения степени воздействия высокодозного фотонного облучения на культуру клеток проводился МТТ-тест (оценка пролиферативной активности клеток), RT-PCR для оценки экспрессии генов, а также Вестерн-блоттинг для оценки относительного количества белка в культуре клеток (метаболическая и репаративная активность клеток). Облучение проводилось на линейном ускорителе, использующимся для лечения пациентов и регулярно проходящем все необходимые процедуры гарантии качества пучка. Фантом облучался одним вертикальным пучком тормозного излучения с номинальной энергией 6 МэВ, мощностью дозы 600 МЕ/мин (1,3, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 125, 150, 200, 250 Гр) и 200 МЕ/мин (5, 20, 80, 150 и 200 Гр). Набор доз несколько варьировался в зависимости от облучаемой культуры. Облучение проводилось однократно. Длительность облучения составила от 10 с (1 Гр, 600 МЕ/мин) до 105 мин (200 Гр, 200 МЕ/мин). Для всех проведенных экспериментов существовала контрольная емкость с клетками, которая не подвергалась облучению, но содержалась в тех же условиях, включая транспортировку. Для качественного проведения эксперимента был изготовлен специальный водоэквивалентный фантом из плексигласа (HU=110). Это позволило добиться максимально однородного дозового распределения в суспензии клеток. На основании полученных в ходе эксперимента данных были построены кривые доза-эффект, иллюстрирующие зависимость от дозы облучения следующих показателей: пролиферативной активности клеток, экспрессии мРНК генов RAD51, XRCC5 и XRCC6, количества белков RAD 51, Ku70 и Ku80, клеточной гибели (апоптоз и некроз). Для определения степени воздействия на пролиферативную активность культур клеток высокодозного фотонного облучения проводился МТТ-тест. Сравнение показателей пролиферативной активности после облучения с разной мощностью дозы демонстрируют снижение эффективности при возрастании времени облучения. Увеличение времени подведения дозы в три раза приводит к уменьшению эффективности в среднем на 9,2 %. По результатам оценки пролиферативной активности культуры клеток глиобластомы пациента С., были построены кривые доза–эффект. Наблюдается резкое уменьшение пролиферативной активности клеток на промежутке от 1 до 40 Гр. Несмотря на дальнейшее увеличение дозы, пролиферативная активность клеток уже существенно не уменьшается. После облучения дозой 250 Гр количество клеток, сохраняющих метаболическую активность, составило 33 %. Такой высокий показатель свидетельствует о наличии пула клеток с очень высокой радиорезистентностью. Впоследствии из клеток, облученных дозой 200 Гр удалось вырастить жизнеспособную культуру. Оценка пролиферативной активности культуры клеток глиобластомы пациента Г. показал, что данная культура обладает существенно более высокой радиорезистентностью, чем не облучавшаяся ранее. Эффект от облучения радиорезистентной культуры клеток, по всей видимости модифицированной первичным облучением, нарастает с увеличением дозы гораздо медленнее. Пролиферативная активность культуры клеток опухоли пациента Г. плавно снижается на и достигает значения 23 % при 150 Гр. В точке максимальной подведенной (250 Гр) дозы количество клеток, сохраняющих метаболическую активность составляет 20 %. Из клеток пациента Г., получивших 200 Гр в результате эксперимента и 60 Гр ранее также удалось вырастить культуру. Для оценки гомологичной рекомбинации и негомологичного сцепливания концов измерялся уровень экспрессии мРНК гена RAD51, генов XRCC6, XRCC5 и относительное количество белка RAD51 и белков Ku70, Ku80 методом вестерн-блоттинга. Выживаемость клеток оценивалась с помощью проточной цитофлуориметрии. Экспрессия мРНК генов RAD 51, XRCC5 и XRCC6 в культуре клеток ранее облученного пациента Г. практически в 40 раз выше, чем аналогичные показатели для культуры клеток пациента С., не облучавшегося ранее. При увеличении дозы облучения экспрессия мРНК снижается. Белок RAD51 один из главных белков, участвующих в репарации ДНК при восстановлении повреждённых ионизирующим излучением стволовых клеток глиом. Его относительное количество в культурах клеток глиобластомы при различных значениях дозы облучения оценивалось методом Вестерн-блоттинга. В культуре клеток опухоли не облученного пациента С. при дозах 3 и 5 Гр отмечено выраженное снижение количества белка RAD51 по сравнению с контролем. Затем отмечается общая тенденция к его увеличению с ростом подведенной дозы (в 3,4 раза на промежутке 5-250 Гр). У ранее облученного пациента Г., в целом, на всем диапазоне подведенных доз отмечается незначительное нарастание количества белка RAD 51 с увеличением дозы. Заметное снижение количества белка RAD51 по сравнению с контролем наблюдается при облучении в дозе 20 Гр. Доза, соответствующая минимальному количеству белка RAD51 в культуре клеток облученного пациента Г. в 4 раза выше, чем соответствующая доза для культуры клеток пациента С. Относительное количество белков Ku70 и Ku80 в культуре клеток пациента С. существенно не меняются с ростом дозы. В культуре клеток пациента Г. заметна некоторая тенденция к росту данного показателя с увеличением дозы. При анализе влияния разных доз облучения на выживаемость клеток глиобластомы ранее облученного пациента Г. получено значение спонтанной гибели клеток в контрольной культуре клеток, равное 81%. Высокий уровень клеточной гибели в контрольных клетках может быть связано с условиями эксперимента. Полученные закономерности и формы кривых доза-эффект могут учитываться при формировании стратегии проведения лучевой терапии у пациентов с глиобластомами и улучшать результаты их лечения благодаря персонализированному подходу. 1. Эскалация дозы с какого-то момента перестает вызывать уменьшение числа метаболически активных клеток. Это согласуется с мнением некоторых клиницистов, считающих неэффективным увеличение суммарной дозы в мишени выше 60 Гр (за 30 фракций) при облучении глиобластом у пациентов. 2. Радиочувствительность клеток заметно снижается при повторном облучении. Поэтому проведение лучевой терапии в стандартном режиме при локальном рецидиве малоэффективно. Тем более, если суммарная доза снижается до 40 Гр. 3. В связи с продемонстрированной низкой эффективностью повторного облучения в режиме радиохирургии, необходимо изучить гипофракционированные режимы с увеличением суммарной подведенной дозы. Изучаемые радиобиологические закономерности, их анализ и интерпретация должны быть использованы при оптимизации лучевого лечения пациентов в сочетании с другими факторами, влияющими на радиочувствительность опухолевых клеток, обуславливая тем самым мультидисциплинарность данного исследования.