ИСТИНА

Для разработки экспрессных, универсальных, высокочувствительных индикаторных систем, которые обеспечили бы флуоресцентное экспресс-определение органических соединений – маркеров АОС - флавоноидов, как в растворе, так и прежде всего, в твердофазном варианте, использовали различные приемы. Один из них - катализируемая ферментом дериватизация флавоноидов амином - 1,2-дифенилэтилендиамином (ДЭД), приводящая к образованию интенсивно флуоресцирующих производных, которые в дальнейшем могут быть использованы в аналитических целях. Предложенный подход позволяет определять флавоноиды на микромолярном уровне и одновременно за 15-30 мин анализировать до 20 образцов проб в ячейказ полистирольного 96-луночного планшета с иммобилизованной в хитозане пероксидазой. При использовании миметика пероксидазы - комплекса железа(III) с тетрамидомакроциклическим лигандом (ТАМЛ) образуется такой же продукт дериватизации флавоноидов, как и в присутствии пероксидазы, однако . чувствительность методик ниже. Те же реакции дериватизации кофейной кислоты ДЭД в присутствии пероксидазы либо ее миметика – комплекса Fe(III) с тетрамидомакроциклическим лигандом (ТАМЛ), использованы для определения окислителя продукта дериватизации - неорганического и органических пероксидов на уровне 5-100 мкМ для экспресс-диагностики окислительного стресса по содержанию пероксидов липидов в крови. Другой перспективной системой для разработки методик определения пероксидов водорода, мочевины и кумола, 2-бутанонпероксида, трет-бутилгидропероксида (ПО 2 - 250 мкМ) оказалась реакция образования флуоресцирующего тройного комплекса Eu(III)-тетрациклин-пероксид, изученная для повышения универсальности пробоподготовки биологических жидкостей (прежде всего крови) не только в водной среде, но и в присутствии органических растворителей ацетона, этанола, ацетонитрила, ДМСО, а также ПАВ - Tween 80, Triton, ДДС и ЦТАБ. Для мультиплексного определения КА применили прием их ферментативной дериватизации с бензиламином (БА) и ДЭД. В целях использования разработанных методик определения КА в биологической жидкости - моче исследовали возможное мешающее влияние избыточных (до 105-кратных) содержаний матричных компонентов мочи. Показали, что при анализе мочи здорового человека из широкого круга матричных компонентов мочи определению, в частности, дофамина незначительно мешает только мочевина в 1000-кратном избытке. Продемонстрирована принципиальная возможность мультиплексного определения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях. Подход к повышению селективности мультиплексного определения КА и их метаболитов одновременно из 1 пробы, реализуется за счет направленного регулирования длины волны возбуждения и испускания: длина волны возбуждения в интервале: 300 – 356 нм; длина волны испускания в интервале: 425 – 480 нм, а также использования разных дериватизирующих агентов - ДЭД и БА. Разработанные методики мультиплексного определения КА и их метаболитов могут быть использованы для экспресс-диагностики по результатам анализа мочи таких заболеваний, как карциноид, феохромоцитома и нейробластома, а также для определения содержания КА и их метаболитов в моче здорового человека. Изучение и сравнение спектральных характеристик продуктов реакций окисления классических субстратов оксидоредуктаз - 2,2′-азобис(3-этил)бензотиазолинсульфоновой кислоты, 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина, и о-фенилендиамина, катализируемых пероксидазой хрена, гемоглобином, цитохромом С и каталазой, выявило возможность, подбора для каждого биокатализатора такого субстрата, измерение поглощения которого (в разных областях спектра) позволит селективно определять один катализатор на фоне других.