ИСТИНА

елью проекта было получение ответов на два взаимосвязанных вопроса: 1. Выяснить, какова молекулярная природа потенциал-независимых натриевых каналов, которые на основании известного механизма активации и инактивации могут быть названы «актин-управляемыми». Наши предварительные результаты позволяют предположить, в качестве рабочей гипотезы, что это амилорид-нечувствительные каналы семейства ENaC; могут рассматриваться также каналы подсемейства TRP, в частности TRPM4 и M5. 2. Определить цитоскелет-зависимый механизм контроля активности «классических» амилорид-чувствительных каналов ENaC реабсорбирующего эпителия почки. Были проведены исследования, направленные на определение молекулярной природы актин-управляемых натриевых каналов. Показана экспрессия на уровне мРНК TRPM4 в клетках лейкемии человека К562 и лимфомы U937. Электрофизиологические тесты, в которых было показано отсутствие кальций-зависимой активации и блокирующего действия 9-фенантрола, не дали аргументов в пользу TRPM4 как возможного молекулярного прототип актин-управляемых каналов в клетках К562 и U937. С помощью метода ОТ-ПЦР показана экспрессия альфа-, бета, гамма- и дельта-hENaC в обеих клеточных линиях. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания подтверждают эндогенную экспрессию альфа-, бета- и гамма-субъединиц ENaC в клетках К562 и U937. Известно, что уникальным свойством классических эпителиальных натриевых каналов является их активация в ответ на действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин, фурин и др. С помощью метода патч-кламп нами было показано, что добавление трипсина (5 мкг/мл) в раствор с наружной стороны мембраны приводит к активации натриевых каналов в клетках К562. Биофизические свойства трипсин-активируемых натриевых каналов совпадают с характеристиками каналов, активирующихся в ответ на разборку цитоскелета с помощью цитохалазина Д. Активность натриевых каналов в ответ на подачу трипсина развивается во времени и не блокируется ингибиторами каналов ENaC амилоридом и его производным бензамилом, что также характерно для актин-управляемых каналов. Было подтверждено отсутствие действия трипсина на актиновый цитоскелет с помощью стабилизатора F-актина фаллоидина (20 мкМ) в экспериментах whole-cell, а также с помощью флуоресцентного окрашивания F-актина. Таким образом, мы обнаружили и изучили механизм регуляции актин-управляемых натриевых каналов, не связанный со сборкой/разборкой цитоскелета. Полученные данные позволяют предположить, что амилорид-нечувствительные эпителиальные натриевые каналы (ENaC) -наиболее вероятный коррелят актин-управляемых каналов в клетках лейкемии К562 и лимфомы U937.Вторым направлением работы по проекту было изучение молекулярных механизмов цитоскелет-зависимой регуляции каналов ENaC, отвечающих за реабсорбцию натрия в эпителии почки. В наших опытах показано повышение вероятности открытого состояния каналов ENaC при действии цитохалазина Д в клетках эпителия почки линии М-1. Были проведены эксперименты inside-out с использованием G-актина для выяснения влияния сборки филаментов на цитоплазматической стороне мембраны на активность каналов. Полученные данные согласуются с гипотезой, что сборка примембранных филаментов способствует переходу каналов ENaC в закрытое состояние.