ИСТИНА

На основании имеющихся рабочих гипотез проведены исследования, направленные на определение молекулярной природы актин-управляемых натриевых каналов. С помощью метода ОТ-ПЦР показана экспрессия hTRPM4 в клетках лейкемии человека K562 и лимфомы U937. В патч-кламп экспериментах на мембранных фрагментах (inside-out) мы не обнаружили зависимости активности актин-управляемых каналов от уровня внутриклеточного кальция в физиологическом диапазоне концентраций 0.01-1 мкМ. Таким образом, полученные на данном этапе результаты не позволяют отнести исследуемые каналы к TRPM4. Поскольку в литературе есть также сведения о возможной активации TRPM4 при экстремальном повышении уровня кальция до 10-100 мкМ, вопрос требует дальнейшего анализа, возможно, дополнительных экспериментов. На уровне мРНК показана экспрессия альфа-, бета-, гамма-hENaC в клетках лейкемии человека K562 и лимфомы U937. В рамках гипотезы о функционировании амилорид-нечувствительных натриевых каналов в клетках крови, просеквенирована нуклеотидная последовательность альфа-hENaC, содержащая предполагаемый сайт связывания с амилоридом в экстраклеточном домене в районе Ser583. Анализ подтвердил специфичность ОТ-ПЦР, однако, показал отсутствие мутаций, которые объясняли бы низкую чувствительность к амилориду. Экспрессия на уровне белка подтверждена для альфа-субъединицы ENaC с помощью иммуноблоттинга и флуоресцентной микроскопии клеток. Проведены предварительные опыты на клетках К562 по оптимизации методик избирательного подавления экспрессии генов ENaC, предполагаемых кандидатов на роль актин-управляемых натриевых каналов. Вторым направлением работы по проекту было изучение молекулярных механизмов цитоскелет-зависимой регуляции каналов ENaC, отвечающих за реабсорбцию натрия в эпителии почки. Основной экспериментальной моделью были клетки почечного эпителия линии М-1. Получены биофизические характеристики каналов, показано повышение активности ENaC в интактных клетках и в мембранных фрагментах (inside-out) при действии цитохалазина Д. Важно отметить, что в нескольких опытах наблюдали инактивацию каналов через 1–2 мин после добавления в раствор глобулярного актина в ионных условиях, способствующей его быстрой полимеризации. Полученные данные согласуются с гипотезой, что сборка примембранных филаментов способствует переходу каналов в закрытое состояние. Эти данные должны быть расширены и дополнены экспериментами с использованием различных форм актина.