ИСТИНА

Ферстеровский резонансный перенос энергии (сокращенно ФРПЭ) представляет собой простейшую и наиболее доступную форму оптических измерений со сверхвысоким разрешением. Исследования с использованием метода ФРПЭ позволяют получать информацию о пространственных конформациях биомолекул и их динамике посредством расчета эффективность переноса энергии между двумя флуорофорами — от метки-донора на метку-акцептор, химически введенными в структуру молекулы. Где от расстояния между флуорофорами зависит эффективность переноса энергии с донора на акцептор. Для введения донорно-акцепторной пары в исследуемую систему используются молекулярные «линкеры». Применение различных «линкеров» к одной донорно-акцепторной паре приводит к возможности расхождения данных для одной и той же исследуемой системы. В итоге, такие факторы, как структура исследуемого объекта, строение «линкеров», концентрация ионов в растворителе, могут привести к неправильной интерпретации полученных данных. В связи со всеми вышеперечисленными факторами присутствует необходимость в моделировании ФРПЭ и оценки влияния перечисленных факторов на значения эффективности ФРПЭ. Работы по моделированию ФРПЭ основываются на таких методах, как молекулярное моделирование и молекулярная динамика, с целью воспроизвести динамику флуорофоров в пространстве. Основное внимание в подобных работах уделяется созданию алгоритмов, позволяющих достаточно точно предсказать экспериментальные значения эффективности ФРПЭ (Deplazes, Jayatilaka, Corry, 2011). Наибольшее внимание в контексте этих работ уделяется таким параметрам, как химические и структурные особенности флуорофоров, подвижность флуорофоров, параметры молекулярной системы, в которую были введены флуорофоры. Одной из проблем, стоящих перед исследователем, является получение параметров, необходимых для запуска молекулярной динамики. А конкретно, данных, описывающих механику движения атомов флуорофоров и распределение парциальных зарядов в флуорофорах. Поскольку зачастую структура флуоресцентной метки не является простой и включает в себя ароматические связи, процесс получения корректных параметров для меток может быть затруднительным. В добавок, в зависимости от способа введения меток может отличаться их структура. Целью работы является изучение влияния молекулярного окружения на эффективности ФРПЭ с использованием метода молекулярной динамики. В данной работе при помощи метода молекулярной динамики мы изучаем, как структурные особенности линкеров, параметры растворителя и значения ионной силы влияют на молекулярную динамику флуоресцентных меток и на теоретические значения эффективности ФРПЭ. В нашей работе в качестве донорно-акцепторной пары были взяты метки цианиновый 3 и цианиновый 5 (Cy3 и Cy5). Данная донорно-акцепторная пара активно применяется при исследовании хроматина путем введения в структуру ДНК, отличается хорошим квантовым выходом (0,31 и 0,21 соответственно) и стабильностью, а также коммерчески доступна, и подходит под типовые спектральные линии лазеров. Для введения флуоресцентных меток в медиальные позиции на ДНК были выбраны “линкеры” представляемые на российском рынке компаниями Syntol и Lumiprobe. Для получения корректного файла топологии мы использовали программную библиотеку ACPYPE, которая представляет собой сценарий-оболочку для программного обеспечения ANTECHAMBER, который упрощает создание топологий и параметров малых молекул для различных программ молекулярной динамики, таких как GROMACS, CHARMM и CNS (Sousa da Silva, Vranken, 2012). В нашей работе мы используем свободное программное обеспечение для возможности повторения проведенных исследований. По этой причине, для расчетов парциальных зарядов мы использовали программный пакет PsiRESP (Alenaizan, Burns, Sherrill, 2020). Полученные параметры использовались для получения файлов топологий .rtp (residue topology parameter file). Полученные файлы rtp модифицировались путем объединения файлов топологий меток с rtp файлом тимидина из силового поля AbmerSB14 (Maier и др., 2015). Таким образом было модифицировано силовое поле AbmerSB14 cufix (Ivani и др., 2016; Yoo, Aksimentiev, 2018) путем создания нового остатка — тимидина с меткой. Результатом создания rtp файла является возможность вводить исследуемые метки в любую позицию в последовательности ДНК. Были созданы 24 атомистические модели с метками введенными в последовательность ДНК. В данных системах варьировались следующие параметры: тип флуорофора (Cy3, Cy5), тип линкера (от компании Syntol и Lumiprobe), концентрация ионов (0,15; 0,30; 1 моль/л), тип модели воды (OPC, TIP3P). Для полученных систем рассчитывались траектории молекулярной динамики. В качестве модельной ДНК была взята последовательность состоящая из 14 пар нуклеотидов. Моделирование проводилось в программе Gromacs 2018 (Abraham и др., 2015) при температуре 300 К и давлении 1 бар; длины траекторий составили 400 нс. Из полученных траекторий мы смогли описать характер взаимодействия меток со структурой ДНК. Мы оценили параметры вращательной диффузии для флуорофоров и использовали полученные траектории для молекулярного моделирования эффективности ФРПЭ для 6 пар позиций в последовательности ДНК. Таким образом мы получили следующие результаты: Составлен протокол генерации файлов (топологии) описывающих движения атомов внутри молекулы и распределение парциальных зарядов. Разработанные наборы параметров не противоречат литературным данным. Метод молекулярной динамики позволяет выявить влияние молекулярного окружения и способа прикрепления меток на эффективность ФРПЭ. Моментальные значения эффективности ФРПЭ значительно зависят от способа введения флуоресцентной метки в ДНК. Такие значения нельзя использовать для прямой интерпретации распределения расстояний между точками прикрепления донорно-акцепторной пары. Увеличение концентрации ионов в моделируемых системах может уменьшить времена контактирования флуорофоров со структурой В ДНК Константа скорости вращательной диффузии флуоресцентных меток Cy3 и Cy5 сопоставима с константой скорости переноса энергии и зависит от модели воды при моделировании молекулярной динамики. Список Литературы Abraham M. J., Murtola T., Schulz R., и др. (2015) GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers, SoftwareX. Т. 1–2. С. 19–25. Alenaizan A., Burns L. A., Sherrill C. D. (2020) Python implementation of the restrained electrostatic potential charge model, Int. J. Quantum Chem. Т. 120. № 2. С. e26035. Deplazes E., Jayatilaka D., Corry B. (2011) Testing the use of molecular dynamics to simulate fluorophore motions and FRET, Phys. Chem. Chem. Phys. Т. 13. № 23. С. 11045–11054. Ivani I., Dans P. D., Noy A., и др. (2016) Parmbsc1: a refined force field for DNA simulations, Nat. Methods. Т. 13. № 1. С. 55–58. Maier J. A., Martinez C., Kasavajhala K., и др. (2015) ff14SB: Improving the Accuracy of Protein Side Chain and Backbone Parameters from ff99SB, J. Chem. Theory Comput. Т. 11. № 8. С. 3696–3713. Sousa da Silva A. W., Vranken W. F. (2012) ACPYPE - AnteChamber PYthon Parser interfacE, BMC Res. Notes. Т. 5. С. 367. Yoo J., Aksimentiev A. (2018) New tricks for old dogs: improving the accuracy of biomolecular force fields by pair-specific corrections to non-bonded interactions, Phys. Chem. Chem. Phys. Т. 20. № 13. С. 8432–8449.