ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Губки (Porifera) – водные, морские или пресноводные многоклеточные животные с фильтрационным питанием и дыханием. У губок отсутствуют обособленный кишечник или кишечная паренхима, нервная и мышечная системы, а также гонады. Организация этих многоклеточных животных во взрослом состоянии крайне примитивна, и единственной обособленной системой, вокруг которой строится вся организация взрослой губки, является водоносная система. Уникальной чертой взрослых губок можно считать мобильность и пластичность их анатомических структур и клеточных линий. Все клетки в теле этих животных способны к активному перемещению, и среди них нет необратимо дифференцированных типов. Анатомические структуры в теле губки также подвергаются постоянной перестройке. Эти непрерывно идущие процессы реорганизации тела позволяют губкам адекватно реагировать на изменения условий окружающей среды (Ересковский, 2005). Одной из форм проявления описанной выше пластичности губок является способность их клеток к реагрегации после диссоциации тканей животного химическими или механическими методами. В ходе реагрегации происходит формирование многоклеточных агрегатов разнообразного строения, а в некоторых случаях и полное восстановление организации губки (с функционирующей водоносной системой, непрерывной экзопинакодермой и развитым мезохилом) (Wilson, 1907; Buscema et al., 1980; Короткова, 1972). Особой стадией процесса реагрегации является формирование так называемых примморфов. Приммморфы представляют собой трехмерные клеточные агрегаты сферической формы. Они обладают тканеподобной структурой и характеризуются наличием непрерывной пинакодермы, отделяющей внутреннюю массу неспециализированных клеток от окружающей среды. Примморфы представляют собой завершение процесса реагрегации клеток. После их окончательного формирования могут начаться процессы регенерации и роста губки (Custudio et al., 1998; Müller et al., 1999). Все это делает процесс реагрегации клеток губок удобной лабораторной моделью, которая позволяет в контролируемых условиях изучать поведение отдельных типов клеток (клеточные деления, миграция, дифференцировка, роль программируемой клеточной смерти), а также процессы восстановления исходных связей между клетками и формирования основных структурных элементов организма. Целью настоящего исследования было отработать методику и проанализировать последовательность реагрегации клеток у двух видов губок из Белого моря, ранее не использовавшихся в подобных работах. Работы была проведена на базе Беломорской биостанции им. Н.А. Перцова биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. В качестве объектов исследования были выбраны три вида, относящиеся к классу Demospongiae: Halichondria panicea (Pallas, 1766), Haliclona aquaeductus (Shmidt, 1862), Halisarca dujardini Johnston, 1842, и один вид, относящийся к классу Calcarea: Leucosolenia complicata (Montagu, 1818). Сбор образцов проводили легководолазным методом. До начала экспериментов губок содержали в аквариумах с биологическими фильтрами при температуре 12-15°С. Затем участки тела губок подвергали механической диссоциации: измельченные кусочки тканей помещали в мешочек из мельничного газа с размером ячеи 200 мкм и протирали сквозь него с помощью пинцета в емкость с фильтрованной морской водой. Полученные суспензии клеток культивировали при постоянной температуре 4°С (первые 24 часа культивирование проходило на орбитальном шейкере при скорости вращения 100 об/мин). В качестве среды для культивирования суспензии клеток использовали фильтрованную морскую воду. Процесс реагрегации регистрировали под микроскопом или бинокуляром. Клеточные агрегаты, сформировавшиеся в суспензиях клеток, были зафиксированы и исследованы методами световой и электронной микроскопии (ТЭМ, СЭМ). Суспензии клеток изученных видов губок, полученные при диссоциации тканей животных, содержали живые клетки. Большинство клеток активно образовывало псевдоподии. Количество и форма псевдоподий варьировали. Хоаноциты некоторое время сохраняли жгутик, но позже втягивали его в клеточное тело. Окраска суспензий йодидом пропидия в комбинации с DAPI показала, что они содержали лишь небольшое количество мертвых клеток. Первые этапы процесса реагрегации начинаются в суспензиях клеток непосредственно после их получения. Нам не удалось наблюдать амебоидного перемещения клеток в суспензии с помощью псевдоподий. Судя по всему, клетки образуют псевдоподии для “обследования” пространства вокруг себя. При соприкосновении псевдоподий двух клеток, между ними возникает контакт, и клетки начинают сближаться друг с другом за счет сокращения псевдоподий. Вероятно, именно таким образом происходит образование первых клеточных агрегатов у исследованных видов. Клетки в составе первых агрегатов также образуют псевдоподии, что способствует присоединению к агрегатам новых клеток и увеличению их размеров. Вместе с тем у губок видов Sycon lingua (Haekel, 1870) и Microciona prolifera (Ellis & Solander, 1786) определенные типы клеток сохраняют свою амебоидную подвижность и после диссоциации тканей. У этих губок процесс реагреагации происходит преимущественно за счет случайных встреч подвижных клеток (Galtsoff, 1923; Короткова, 1972). Процесс реагрегации клеток у исследованных видов включает в себя несколько стадий. В целом, данный процесс проходит сходным образом у всех исследованных губок. Тем не менее, скорость его протекания и детали строения формирующихся клеточных агрегатов отличаются у разных видов. Первой стадией реагрегации клеток являются первичные клеточные агрегаты. Они представляют собой агрегаты размером 100-500 мкм, имеющие неровную поверхность и разнообразную форму (от сферической до сложной разветвленной). У H. panicea, H.aquaeductus и L. complicata данная стадия реагрегации является продолжительной - первичные клеточные агрегаты данных видов встречаются в культурах в течение 3-5 суток после диссоциации тканей животных. У Halisarca dujardini реагрегация клеток проходит заметно быстрее и первичные клеточные агрегаты встречаются вкультурах этого вида только в течение первых часов после диссоциации тканей животного. Следующей стадией процесса реагрегации явлются ранние примморфы (Рис. 2, В, Г). По сравнению с первичными клеточными агрегатами ранние примморфы выглядят более плотными, имеют большие размеры и более правильную сферическую форму. Однако поверхность ранних примморфов остается неровной. У H. panicea и H. aquaeductus преобразование первичных клеточных агрегатов в ранние примморфы сопровождается выделением на поверхности агрегатов оболочки из клеточного дебриса и занимает от 2 до 5 суток. У L. complicata и H. dujardini формирование ранних примморфов проходит быстрее: у первого вида за 24 часа, у второго - за несколько часов. У данных видов выделения клеточного дебриса не наблюдалось. Ранние примморфы были последней стадей реагрегагии клеток H. aquaeductus. Они появляются в культурах этого вида через 5-8 суток после диссоциации тканей губки и сохраняю жизнеспособность более месяца, не претерпевая дальнейщего развития. У остальных исследованных видов ранние примморфы преобразовываются в примморфы. Данные агрегаты всегда имеют правильную сферичкую форму и очень гладкую поверхность. Примморфы были последней стадией реагрегации клеток H. panicea и L.complicata. Примморфы данных видов появляются в культурах на 5-6 сутки после диссоциации тканей животных и также, как ранние примморфы H. aquaeductus,сохраняют жизнеспособность более месяца без дальнейшего развития. В культурах H. dujardini формирование примморфов происходит гораздо быстрее - через 24 часа после диссоциации тканей губки. Кроме того, примморфы данного вида способы к прогрессивному развитию, заканчивающемуся восстановлением исходной организации губки. На 2-3 сутки примморфы H. dujardini прикрепляются к субстрату, на 6-7 сутки в них становятся заметны первые полости водоносной системы, на 8-9 сутки – водоносная система хорошо развита и начинаются формирование оскулюмов. На 10-12 сутки оскулюмы открываются и губки начинают фильтровать воду. Описанные преобразования происходят и с неприкрепленными примморфами H. dujardini, но на стадии формирования оскулюмов у таких примморфов образуется несколько зачатков оскулюмов. Однако в последствии откроется и будет функционировать только один из оскулюмов. Были проведены гистологические исследования клеточных агрегатов и примморфов H. panicea и H. aqueductus. Изучение клеточных агрегатов обоих видов методами световой и электронной микроскопии показало, что на данной стадии реагрегации клетки имеют форму близкую к округлой и еще неплотно упакованы в составе агрегатов. Клетки в составе агрегатов разделяют значительные пространства. Клеточные агрегаты изученных видов состоят из клеток двух размерных классов – мелких (2-5 мкм) и крупных (8-20 мкм). Большая часть клеток в составе агрегатов имеет размеры 2-5 мкм, реже встречаются крупные клетки размером 8-20 мкм. К этому времени большинство мелких клеток теряет признаки своей исходной дифференцировки. Тем не менее, изредка в составе клеточных агрегатов возрастом 1-3 суток встречаются хоаноциты, которые еще несут на своей апикальной поверхность жгутик и воротничок из микровилле. Большинство крупных клеток несет в цитоплазме еще немногочисленные фагосомы. Реже встречаются крупные клетки, в цитоплазме которых находятся включения с гомогенным содержимым или вакуоли с бактериями. Преобразование первичных клеточных агрегатов в ранние примморфы приводит к уменьшению количества мелких клеток (размером 2-5 мкм) в составе агрегатов и к уплотнению упаковки оставшихся более крупных клеток. Ранние примморфы H. panicea состоят из плотноупакованных клеток, между которыми лежат тяжи внеклеточного матрикса. На поверхности ранних примморфов лежат отдельные пинакоциты, которые пока не формируют сплошного слоя. Преобразование ранних примморфов H. panicea в примморфы, сопровождается формированием на их поверхности сплошного слоя пинакоцитов, который полностью отделяет внутреннюю массу клеток от внешней среды. В ранних примморфах H. aquaeductus формируются три зоны, расположенные в направлении от периферии к центру агрегата. На поверхности агрегатов данного вида находится слой амебоидных клеток, соединенных большим количеством цитоплазматических отростков и имеющих слегка уплощенную форму. Между этими клетками нет тяжей внеклеточногоматрикса. Глубже располагается очень плотный слой клеток, которые буквально “зацементированы” в сплошной внеклеточный матрикс. Наконец, в центре агрегатов лежит довольно рыхлый слой, состоящий из округлых клеток и отдельных тяжей внеклеточного матрикса. В дальнейшем у агрегатов H. aquaeductus на поверхности появляются пинакоциты. Тем не менее, у этого вида пинакоциты никогда не образуют сплошного слоя на поверхности: встречаются лишь отдельные пинакоциты, большая часть клеток поверхности сохраняет амебоидную форму и несет большое количество сильно разветвленных псевдоподий. Также были проведены предварительные исследования интенсивности клеточной пролиферации в ход процесса реагрегации клеток у H. aquaeductus и L. complicata. Для обнаружения делящихся клеток была использована BrdU-метка. Было показано, что интенсивность деления клеток в составе клеточных агрегатов и примморфов H. aquaeductus падает с увеличением возраста агрегата. Так, клеточные агрегаты в возрасте 4 суток содержали большое количество меченых клеток. В составе ранних примморфов возрастом 9 суток встречались лишь отдельные меченые клетки. Наконец, ранние примморфы возрастом 12 суток вообще н содержали меченых клеток. Подобные эксперименты с агрегатами L. complicata выявили очень низкий уровень клеточной пролиферации на протяжении всего процесса реагрегации клеток у данного вида - встречались лишь отдельные клетки, включившие метку. Кроме того, у клеточных агрегатов и примморфов L. complicata с помощью TRMR Kit определяли интесивность апоптоза. Эти эксперименты показали наличие апоптирующих клеток в составе агрегатов L. complicata на всех стадиях реагрегации клеток. Большинство апоптирующих клеток располагалось в переферических частях агрегатов. Данная работа позволила отработать методики получения клеточных агрегатов из суспензий клеток губок и определить основные этапы процесса реагрегации клеток у двух видов беломорских губок. Это послужит основой для более детальных исследований процесса реагрегации. Предстоит изучить роль и поведение различных типов клеток, формирование новых межклеточных контактов и восстановление внеклеточного матрикса и скелетных элементов в ходе этого процесса. How to cite: Lavrov A and Kosevich I. Dynamic of the cell reaggregation process in several species of White Sea sponges [version 1; not peer reviewed]. F1000Research 2017, 6:1048 (slides) [Russian] (doi: 10.7490/f1000research.1114348.1)
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | Презентация | Lavrov.pptx | 2,0 МБ | 6 июля 2017 [gonoduct] |