|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Исследование влияния потенциальных эпигенетических лекарств на компартментализацию хроматина и энхансер-промоторные контакты в нормальных и опухолевых клетках человекаНИР
Study of potential epigenetic drug effects on chromatin compartmentalization and enhancer-promoter contacts in normal and cancer human cells
- Руководитель НИР: Ульянов С.В.
- Ответственный исполнитель: Ломов Н.А.
- Участники НИР: Кантидзе О.Л.
- Подразделение: Кафедра молекулярной биологии
- Срок исполнения: 9 августа 2019 г. - 30 июня 2022 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 19-74-10009
- Номер ЦИТИС: АААА-А19-119082190048-7
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: Физико-химические основы биологии и биотехнологии
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биомедицинские и ветеринарные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.15 Пространственная структура и свойства биополимеров
- 34.15.25 Молекулярная биология гена
-
Ключевые слова:
регуляция транскрипции, хроматин, энхансер-промоторная коммуникация, компартменты, разделение фаз
enhancer-promoter communication, chromatin, compartments, transcription regulation, phase separation -
Описание:
В клетках человека пространственная организация интерфазного хроматина имеет несколько уровней иерархии. В пределах хромосомной территории и ядра в целом активные и репрессированные геномные регионы пространственно сегрегированы в составе А- и В-компартментов. На масштабе порядка нескольких сотен-миллиона пар нуклеотидов, хроматиновая фибрилла образует глобулярные структуры (топологически-ассоциированные домены, ТАДы), включающие один или несколько генных локусов и ограничивающие зоны действия энхансеров. Многие ТАДы формируются посредством образования CTCF/когезин-зависимых петель, возникающих по механизму экструзии. Петли обнаруживаются и внутри ТАДов, где порядка 30% петлевых взаимодействий устанавливаются между регуляторными элементами (в частности, энхансерами и суперэнхансерами) и подконтрольными промоторами. На сегодняшний день механизмы формирования компартментов, а также коммуникации между энхансерами и промоторами во многом остаются неясными. Согласно широко обсуждаемой модели, одной из возможностей может быть формирования макромолекулярных конденсатов посредством разделения фаз в хроматине. В образовании подобных конденсатов могут принимать участие крупные РНК-белковые комплексы, собирающиеся на энхансерах и включающие в свой состав ряд белков с неструктурированными доменами и бромодомен-содержащие белки, в частности семейства ВЕТ. В данном проекте мы планируем обрабатывать нормальные и раковые клетки человека 1,6-гександиолом, который препятствует образованию конденсатов, и BET-ингибитором JQ1, нарушающим работу комплексов, построенных на основе бромодомен-содержащих активаторов транскрипции. В обработанных и контрольных клетках мы планируем анализировать топологию генома на уровне компартментов, топологически-ассоциированных доменов и энхансер-промоторных контактов с использованием процедуры Hi-C. Данные об изменении структуры компартментов на фоне обработки 1,6-гександиолом будут подтверждены с использованием флуоресцентной гибридизации in situ, а эффекты, оказанные на структуру ТАДов и петель, будут соотнесены с полногеномным профилем связывания архитектурного белка CTCF, который мы охарактеризуем методом ChIP-seq. Задачи, поставленные в данном проекте, являются новыми и актуальными для трёхмерной геномики, молекулярной биологии хроматина и в области изучения свойств эпигенетических лекарств. Результаты выполнения данного проекта не только дополнят и расширят наши представления о взаимосвязи топологии генома и регуляции его работы, но окажутся востребованными при создании рациональных стратегий дизайна и испытаний препаратов, чьими мишенями являются хроматин-ассоциированные ферментные системы.
-
Abstract:
Several hierarchic levels are known for the spatial organization of interphase chromatin in human cells. Active and repressed genome regions are spatially segregated from each other to form the A and B compartments within a chromosome territory and the whole nucleus. At the scale of several hundreds of base pairs to one megabase, a chromatin fiber forms globular structures (topologically associated domains, TADs), which include one or several gene loci and restrict the zone of enhancer action. Many TADs originate from the formation of CTCF/cohesin-dependent loops, which arise via an extrusion mechanism. Loops are found within TADs as well, where interactions established between regulatory elements (in particular, enhancers and super-enhancers) and their target promoters account for approximately 30% of all loop interactions. The mechanisms whereby compartments form and enhancers and promoters communicate with each other are still poorly understood. A model widely discussed now suggests that the formation of macromolecular condensates via phase separation in chromatin may provide such a mechanism. The formation of condensates may involve the large RNA-protein complexes that assemble on enhancers and incorporate a number of proteins with disordered domains and bromodomain-containing proteins, in particular, those of the BET family. In this project, we intend to treat normal and cancer human cells with 1.6-hexanediol, which prevents the condensate formation, and the BET inhibitor JQ1, which distorts the function of complexes based on bromodomain-containing transcriptional activators. Cells treated with the agents and control cells will be tested for genome topology at the levels of compartments, TADs, and enhancer-promoter interactions by the high-throughput C-method (Hi-C). Data on the changes observed in compartment structure after 1,6-hexanediol treatment will be verified by fluorescence in situ hybridization; the effects on the TAD and loop structures will be collated with a genome-wide CTCF binding profile, which will be obtained by the ChIP-seq method. The goals of the project are new and important for the fields of 3D genomics, chromatin molecular biology, and properties of epigenetic drugs. The results of the project will supplement and extend the understanding of how the topology of the genome is associated with the regulation of its function and will be of use to develop rational strategies for designing and testing the drugs that target chromatin-associated enzyme systems.
-
Планируемые результаты:
В ходе выполнения запланированных в данном проекте экспериментов будут получены следующие конкретные научные результаты: 1. Будет решён вопрос о том, играет ли какую-либо роль процесс разделения фаз в образовании А- и В-компартментов в интерфазном хроматине нормальных и опухолевых клеток человека. 2. Будет выяснено, играет ли роль процесс разделения фаз в формировании петлевых и беспетлевых топологически-ассоциированных доменов в геноме человека. 3. Будет установлено, приводит ли нарушение формирования макромолекулярных конденсатов к изменению полногеномного профиля связывания архитектурного белка хроматина CTCF. 4. Будет получен ответ на вопрос о том, формируется ли регуляторная контактная сеть суперэнхансеров посредством образования макромолекулярных конденсатов, и в частности образующихся на основе комплексов бромодомен-содержащих белков ВЕТ-семейства. Полученные результаты позволят значительно расширить представления о механизмах установления и поддержания пространственной структуры интерфазного хроматина на уровне компартментов, топологически-ассоциированных доменов и активаторных энхансер-промоторных блоков, и могут быть использованы при построении стратегии дизайна и экспериментальной проверки лекарственных препаратов, нацеленных на модулирование работы регуляторных систем, управляющих транскрипцией и эпигенетическим статусом хроматина.
-
Научный задел:
Коллектив участников данного проекта обладает обширным экспериментальным опытом в изучении топологии хроматина и её взаимосвязи с эпигенетической регуляцией функционирования генома. Это нашло отражение в успешном выполнении ряда проектов, результаты которых были опубликованы в высокорейтинговых международных журналах. Обширный научный задел, налаженное взаимодействие с группами, занимающимися анализом данных экспериментов Hi-C и ChIP-seq (группа М. Гельфанда, Сколтех; группа А. Тяхта, ИБГ РАН) позволяет рассчитывать на успешное выполнение всех поставленных в данном проекте задач. Коллектив обладает наборами реагентов, оборудованием (планируется его частичное обновление за счёт средств гранта) и доступом к вычислительным ресурсам (вычислительный комплекс факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, суперкомпьютер "Ломоносов-2") для проведения запланированных экспериментов и всестороннего анализа полученных данных.
-
Основные результаты:
В данной работе с использованием иммуноцитохимического окрашивания компонентов ядерных телец, полногеномного анализа топологии хроматина на разных масштабах, флуоресцентной гибридизации in situ с пробами из активных и репрессированных областей генома, и профилирования связывания архитектурного белка CTCF мы планируем получить ответ на вопрос о том, играют ли роль макромолекулярные конденсаты в компартментализации интерфазного хроматина и в установлении энхансер-промоторных контактов в нормальных и опухолевых клетках человека.
- Добавил в систему: Ульянов Сергей Владимирович
Источник финансирования НИР
| грант РНФ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 1 сентября 2019 г.-30 июня 2020 г. | Исследование влияния потенциальных эпигенетических лекарств на компартментализацию хроматина и энхансер-промоторные контакты в нормальных и опухолевых клетках человека |
| Результаты этапа: В ходе выполнения первого этапа НИР мы получили Hi-C библиотеки из клеток линии HeLa, обработанных гександиолом (агент, разрушающий фазы в жидкости) в концентрации 5% (опыт); из клеток, которые после обработки были отмыты от агента свежей средой и выдержаны в течение 1.5 часов (восстановление), и из контрольных клеток, не подвергавшихся никаким обработкам. Hi-C библиотеки были получены стандартным протоколом, ранее оптимизированном нами для работы с клетками дрозофилы и человека. Библиотеки были приготовлены в двух независимых биологических повторностях с использованием рестриктазы DpnII, секвенированы 80-100 млн парных ридов на платформе Illumina HiSeq 4000 (Genewiz, USA), и процессированы с использованием программного пакета hiclib (MirnyLab, MIT, USA). После использования всех фильтров этого пакета (в частности, удаление ПЦР-дупликатов; пар ридов, картированных на один рестриктный фрагмент; неуникально картированных ридов) и слияния биологических повторностей (коэффициент корреляции между ними был определён как 0.9-0.95) порядка 30-40% исходных данных было использовано для построения карт пространственной организации хроматина. Были получены карты с разрешением 20-500 тпн. Контроль качества проведения процедуры Hi-C осуществляли посредством построения зависимостей частот контактов от геномного расстояния (скейл-плоты) и определения отношения cis/trans контактов. Скейл-плоты имели типичную форму (монотонное убывание с двумя перегибами на масштабах порядка 500 тпн и 10 мпн) во всех образцах, в то время как отношение cis/trans значительно отличалось в образцах восстановления (порядка 2, в то время как в контрольных и опытных образцах это отношение имел значение около 5.5), данный феномен нашёл объяснение в нашем последующем анализе частот контактов внутри компартментов. В картах с использованием метода анализа главных компонент были аннотированы хроматиновые компартменты. В целом, профили компартментов оказались в значительной мере скоррелированы между всеми тремя типами библиотек, однако на фоне обработки гександиолом мы выявили небольшое увеличение доли В-компартмента (примерно с 45% до 55% длины генома). Корректность определения профиля компартментов валидировали путём сравнения с данными профилирования транскриптома методом RNA-seq, доступными в базе данных ENCODE. Как и ожидалось, уровень транскрипции в компартменте А оказался значительно выше, чем в компартменте В, что подтверждает правильность нашей аннотации компартментов. Далее, мы рассчитали показатель, который в литературе называется силой компартментов и представляет собой отношение числа контактов внутри анализируемого компартмента к общей сумме контактов в карте. Согласно полученным нами результатам, обработка гександиолом (и, соответственно, нарушение разделения фаз в хроматине) и последующее восстановление сопровождаются увеличением и последующем уменьшением ниже контрольного уровня силы компартмента А in cis и in trans. Сила компартмента В при этом падает при обработке гександиолом, и поднимается выше контрольного уровня в период восстановления после отмывки гександиола. Таким образом, компартменты реагируют противоположным образом на разрушение фаз. Для более детального анализа структуры компартментов мы разработали применили так называемый пентадный анализ. Он заключается в том, что вся карта контактов разделяется на пять типов областей: контакты внутри компартмента А вдоль диагонали карты (зона А), контакты внутри компартмента В вдоль диагонали карты (зона В), контакты внутри компартмента А вдали от диагонали (зона АА), контакты внутри компартмента В вдали от диагонали (зона ВВ), контакты между компартментами (зона АВ). Далее, зоны, принадлежащие к одному типу, усредняются по всему геному, что позволяет анализировать тенденции изменения профиля контактов в компартментах на разных масштабах расстояний. Полученные нами данные сводятся к следующему: (1) Обработка гександиолом приводит к частичному перемешиванию компартментов (рост числа контактов в зоне АВ). (2) Обработка гександиолом приводит к частичному разрыхлению компартмента В на всех масштабах расстояний. (3) Компартмент А дифференциально реагирует на обработку гександиолом: в зоне А наблюдается рост плотности контактов, а в зоне АА – падение плотности. (4) При отмывке гександиола (период восстановления) не происходит возврата хроматина к изначальной пространственной конфигурации: компартмент В становится значительно более плотным, чем в контроле, в то время как компартмент А разрыхляется in cis, и участки из него устанавливают множество новых контактов in trans (за счёт чего и падает отношение cis/trans в образцах восстановления). Таким образом, мы установили, что жидкостное разделение фаз, хотя и вносит ощутимый вклад в структуру компартментов, не является определяющей силой их формирования. Разрушение фазовой структуры с последующим её восстановлением не приводит к возврату хроматина в изначальное состояние, но устанавливает его новую пространственную конфигурацию, в которой компартмент В оказывает упакован значительно плотнее, чем в контрольных клетках, а компартмент А завязывает множественные in trans взаимодействия. | ||
| 2 | 1 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. | Исследование влияния потенциальных эпигенетических лекарств на компартментализацию хроматина и энхансер-промоторные контакты в нормальных и опухолевых клетках человека |
| Результаты этапа: За отчётный период получены следующие конкретные научные результаты: 1. Получены Hi-C карты нормальных фибробластов человека на фоне обработки 1,6-ГД с разрешением 100 тпн. Подсчёт доли контактов, приходящихся на взаимодействия внутри компартментов (тип контактов АА и ВВ), а также между компартментами (тип АВ) показал, что обработка 1,6-ГД приводит к нарушению структуры компартментов, выражающемуся в их частичном перемешивании (увеличение доли контактов типа АВ). То есть, в нормальных клетках человека жидкостно-жидкостное разделение фаз также играет ограниченную роль в поддержании крупномасшатбной структуры хроматина на уровне компартментов. В настоящее время мы продолжаем анализ этих данных с использованием пентадного алгоритма с тем, чтобы проследить изменения в структуре компартментов на разных масштабах геномных расстояний. 2. Анализ данных STORM-микроскопии с визуализацией нуклеосом показал, что обработка клеток 1,6-ГД приводит к изменению формы распределения L-функции, которая количественно описывает вероятность обнаружения пары контактирующих молекул в зависимости от радиального расстояния. В контрольных клетках L-функция имела узкий и высокий пик на небольших радиальных расстояниях, что свидетельствует о наличии плотных нуклеосомных кластеров. Обработка клеток ингибитором гистондеацетилаз бутиратом натрия ожидаемо приводила к значительному снижению высоты пика, что сговорит о более дисперсном расположении нуклеосом в пространстве ядра. К такому же эффекту приводила обработка клеток 1,6-ГД. Интересно, что удаление 1,6-ГД из среду не приводило к возвращению формы распределения L-функции к исходному состоянию (как и в случае силы компартментов, как нами было показано на предыдущем этапе выполнения проекта). Эти данные свидетельствуют о том, что жидкостно-жидкостное разделение фаз частично ответственно за формирование нуклеосомных кластеров. Данные STORM-микроскопии с визуализацией белка гетерохроматина HP1 и РНК-полимеразы II в настоящее время находятся в обработке. 3. В Hi-C данных с разрешением 20 тпн мы аннотировали 4956, 4694 и 5010 ТАДов в контрольных клетках, в клетках после обработки 1,6-ГД и в клетках, инкубированных в свежей среде роста после обработки 1,6-Г, соответственно. Некоторое увеличение количества ТАДов в последнем случае связано, по всей видимости, с тем, что карта в целом стала несколько более контрастной, что повлияло на успешность аннотирования доменов. Анализ структуры ТАДов показал, что только ТАДы из компартмента А статистически значимо отвечают на обработку клеток 1,6-ГД: мы зафиксировали обратимое возрастание их плотности, и снижение инсуляции на границах. 4. В Hi-C данных с разрешением 20 тпн 2837, 2381 и 5709 хроматиновых петель в контрольных клетках, в клетках после обработки 1,6-ГД и в клетках, инкубированных в свежей среде роста после обработки 1,6-Г, соответственно. Анализ интенсивности взаимодействий показал, что обработка 1,6-ГД значимо снижает частоту энхансер-промоторных, но не промотор-промоторных контактов. Как и в случае плотности ТАДов, это снижение обратимо, и интенсивность взаимодействий между энхансерами и промоторами возвращается к контрольному уровню после удаления 1,6-ГД из среды роста. CTCF-зависимые петли практически не меняли свою интенсивности при обработке 1,6-ГД. Таким образом, из всех проанализированных типов взаимодействий разделение фаз вносит наибольший вклад в энхансер-промоторные контакты. 5. Анализ профиля CTCF показал, что 1,6-ГД никак не влияет на связывание этого белка с ДНК, что объясняет практически полное отсутствие снижения интенсивности CTCF-зависимых петель при обработке 1,6-ГД. | ||
| 3 | 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. | Исследование влияния потенциальных эпигенетических лекарств на компартментализацию хроматина и энхансер-промоторные контакты в нормальных и опухолевых клетках человека |
| Результаты этапа: Выполнен анализ профиля связывания архитектурного белка CTCF в клетках HeLa на фоне обработки 1,6-ГД методом ChIP-seq с антителами от Active Motif (#61311). Бибилиотеки для секвенирования были приготовлены с использованием набора реагентов NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina (New England Biolabs). Библиотеки были секвенированы на платформе Illumina NovaSeq 6000 с глубиной чтения 40 млн одноконцевых прочтения длиной 100 н. Прочтения были выровнены на референсный геном hg19 с использованием Bowtie v2.2.3. Множественные картирования и дупликаты были отфильтрованы SAMtools v1.5. Аннотация пиков была осуществлена с использованием PePr с порогом p-value 1e–5 и скользящим окном 100 пн. Анализ профиля CTCF показал, что 1,6-ГД никак не влияет на связывание этого белка с ДНК, что объясняет практически полное отсутствие снижения интенсивности CTCF-зависимых петель при обработке 1,6-ГД. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".