![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
На сегодняшний день в экспериментальной физиологии сердца отсутствуют дешевые и релевантные модельные объекты, электрофизиологический фенотип миокарда которых в достаточной степени близок к человеческому. Главной причиной этого являются различия в наборе калиевых токов, участвующих в реполяризации миокарда человека и модельных животных. Полным набором ионных токов, характерных для человеческого миокарда, обладают кролик и свинья, однако это достаточно дорогостоящие и сложные в содержании экспериментальные животные, доступные не каждой лаборатории. Таким образом, актуальной проблемой является поиск новых, более дешевых и релевантных модельных животных для проведения фундаментальных и прикладных исследований в области электрофизиологии сердца. На данный момент исследование электрофизиологических аспектов работы сердца затронуло практически все основные систематические группы позвоночных животных, при этом в зависимости от поставленной задачи некоторые из этих животных – такие как рыбы (Danio rerio), амфибии (Rana temporaria) – широко используются в качестве модельных объектов. Вместе с тем, практически неисследованным с электрофизиологической точки зрения остается сердце птиц. В связи с этим, целью данного проекта является исследование электрофизиологических основ функционирования сердца птиц на примере японского перепела. Реализация данного проекта позволит непосредственно ответить и на более прикладной вопрос: могут ли птицы стать новым модельным объектом в электрофизиологии сердца? Для реализации настоящего проекта будут использованы несколько методических подходов. Биоэлектрическая активность рабочего миокарда, а также локализация и электрическая активность пейсмекерного миокарда перепела будут исследованы в изолированных многоклеточных препаратах миокарда путем внутриклеточной регистрации электрической активности с помощью острых стеклянных микроэлектродов. Этот же метод будет использован для изучения влияния блокаторов основных ионных токов миокарда на конфигурацию его электрической активности. С использованием метода пэтч-кламп будут зарегистрированы и охарактеризованы основные токи, формирующие электрическую активность миокарда перепела. Иммуноцитохимический метод и метод количественной ПЦР в реальном времени будут использованы для идентификации молекулярной природы каналов, опосредующих обнаруженные ионные токи в миокарде перепела, и определения уровня их экспрессии. С помощью иммуногистохимического метода в комбинации с микроэлектродным исследованием будут определены точное местоположение и структура водителя ритма сердца перепела. Таким образом, настоящее исследование подразумевает не только комплексную характеристику биоэлектрической активности сердца птиц и ее молекулярных основ, но также оценку перспектив использования данной группы животных в качестве модельных объектов в кардиологических исследованиях. Аналогичные работы ранее не проводились.
At the moment, experimental cardiac physiology does not possess cheap and relevant model objects whose electrophysiological myocardial phenotype is close enough to that in human. The main reason for this issue are the differences in the set of potassium currents contributing to repolarization of myocardium in human and experimental animals. Only rabbit and pig possess the full set of ionic currents similar to that in human myocardium, however, these animals are quite expensive and difficult to keep, and therefore available not in every laboratory. Thus, the search for new, more cheap and relevant model animals for fundamental and applied researches in the field of cardiac electrophysiology is an actual issue. For the present day, the studies of cardiac electrophysiology have involved almost all the main systematic groups of vertebrate animals. Moreover, depending on the research tasks, some of these animals – such as fishes (Danio rerio), amphibians (Rana temporaria) – are widely used as model objects. At the same time, avian heart remains almost unexplored in electrophysiological aspect. In light of this issue, the goal of the present project is to study the electrophysiological basis of avian heart function in Japanese quail. The realization of this project will also allow us to address a more applied question: if birds could become a new model objects in the field of cardiac electrophysiology? Several methodical approaches will be used to accomplish this project. The bioelectrical activity of working myocardium, as well as localization and electrical activity of pacemaker myocardium of quail, will be studied in isolated multicellular preparations using sharp glass microelectrodes. The same approach will be used to reveal how the blockers of major ionic currents affect the configuration of bioelectrical activity in myocardial preparations. The main ionic currents contributing to electrical activity in quail myocardium will be recorded and described using standard patch clamp method. Immunocytochemical staining and quantitative real time PCR (RT-PCR) will be used to identify the molecular nature of the channels that mediate the discovered ionic currents in quail myocardium and to evaluate their expression levels. Using immunohistochemical staining, we will determine the exact localization of the pacemaker in quail heart and describe its structure. Thus, the present study encloses not only complex description of the bioelectrical activity and its molecular basis in avian heart, but also the evaluation of how perspective is the usage of this group of animals as model objects in cardiology researches. None similar researches have been performed before.
1) Охарактеризовать электрическую активность рабочего миокарда перепела в нормальных условиях. 2) Выявить изменения конфигурации электрической активности миокарда перепела в условиях подавления различных ионных токов. 3) Определить локализацию и структуру водителя ритма сердца перепела, охарактеризовать его электрическую активность. 4) Охарактеризовать основные ионные токи, определяющие конфигурацию электрической активности миокарда, в изолированных предсердных и желудочковых кардиомиоцитах перепела. 5) Идентифицировать молекулярную природу ионных каналов, переносящих обнаруженные токи. 6) Определить уровни экспрессии генов каналов, опосредующих основные ионные токи в миокарде перепела.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 октября 2019 г.-2 сентября 2020 г. | Электрофизиологические характеристики миокарда японского перепела (Coturnix japonica) и перспективы его использования в качестве модельного объекта |
Результаты этапа: В 2020 году были исследованы особенности биоэлектрической активности рабочего миокарда японского перепела (Coturnix japonica). С использованием стандартной микроэлектродной техники было показано, что (1) потенциал покоя рабочего миокарда перепела сходен с таковым, зарегистрированным в миокарде млекопитающих; (2) потенциалы действия в желудочковом миокарде перепела характеризуются более выраженной фазой плато и большей длительностью по сравнению с таковыми в предсердном миокарде, а соотношение конфигураций потенциалов действия в предсердном и желудочковом миокарде перепела напоминает таковое у кролика, являющегося классическим модельным объектом в кардиологии; (3) потенциалы действия в желудочковом миокарде японского перепела имели значительно большую скорость нарастания переднего фронта по сравнению с предсердными потенциалами действия. Также впервые было показано, что под действием селективных блокаторов основных ионных токов, участвующих в реполяризации миокарда других позвоночных животных, а именно дофетилида (блокатор быстрого тока задержанного выпрямления IKr), HMR 1556 (блокатор медленного тока задержанного выпрямления IKs) и 4-аминопиридина (в миллимолярных концентрациях блокатор транзиторного выходящего тока Ito), длительность потенциалов действия, регистрируемых в препаратах правого предсердия и правого желудочка перепела, увеличивалась на различных уровнях реполяризации. Это свидетельствует о вкладе соответствующих токов в реполяризацию рабочего миокарда перепела. При этом 4-аминопиридин в меньшей концентрации (100 мкМ) был неэффективен, что говорит об отсутствии ультрабыстрого тока задержанного выпрямления IKur. Также в 2020 году с использованием метода фиксации потенциала пэтч-кламп в изолированных кардиомиоцитах перепела были зарегистрированы основные ионные токи, формирующие электрическую активность миокарда. Показано наличие быстрого и медленного токов задержанного выпрямления, IKr и IKs¬, опосредующих реполяризацию миокарда. Кроме того, в изолированных кардиомиоцитах перепела впервые был зарегистрирован транзиторный выходящий ток Ito, участвующий в ранней реполяризации миокарда. До настоящего времени считалось, что, за исключением млекопитающих, данный ток отсутствует в миокарде позвоночных животных. Зарегистрированы токи выходящего выпрямления: основной ток IK1, участвующий в поздних стадиях реполяризации и в поддержании потенциала покоя, в предсердных кардиомиоцитах был также обнаружен ацетилхолинзависимый ток IKACh, ответственный за гиперполяризацию миокарда и ускорение реполяризации при активации парасимпатической системы. Роль данного тока была проиллюстрирована в дополнительных экспериментах на препаратах правого предсердия перепела: аппликация ацетилхолина приводила к гиперполяризации миокарда и укорочению потенциалов действия. Также в изолированных кардиомиоцитах перепела были зарегистрированы деполяризующие токи: быстрый натриевый ток INa и кальциевый ток L-типа (ICaL). Однако, вопреки результатам более ранних исследований, кальциевый ток T-типа (ICaT) в кардиомиоцитах перепела не был обнаружен, ток ICaL имел значительную амплитуду, по сравнению с таковой у млекопитающих. Поскольку кардиомиоциты птиц имеют морфологию и ультраструктуру, характерную для кардиомиоцитов рептилий, и не имеют поперечных (Т-) сарколеммальных трубочек, необходимых для быстрого электромеханического сопряжения в миокарде млекопитающих, полученные результаты выявили необходимость дополнительных экспериментов для изучения функции саркоплазматического ретикулума (СПР) в кардиомиоцитах перепела и оценки степени взаимодействия между СПР и сарколеммальными кальциевыми каналами. Показано, что емкость СПР в миокарде перепела значительно превосходит таковую, показанную для кардиомиоцитов млекопитающих, а сарколеммальные кальциевые каналы взаимодействуют с выбросом Ca2+ из СПР. Данные особенности круговорота кальция обеспечивают в отсутствие Т-трубочек быстрые и сильные сокращения миокарда птиц. | ||
2 | 3 сентября 2020 г.-30 сентября 2021 г. | Электрофизиологические характеристики миокарда японского перепела (Coturnix japonica) и перспективы его использования в качестве модельного объекта |
Результаты этапа: 1. Описаны базовые характеристики электрической активности рабочего миокарда перепела. Рабочий миокард японского перепела имеет сильно отрицательный потенциал покоя, различий в его уровне между предсердным и желудочковым миокардом нет. Потенциалы действия в желудочковом миокарде имеют большую длительность по сравнению с предсердиями; соотношение длительностей потенциалов действия в желудочковом и предсердном миокарде перепела близко к таковому у млекопитающих средних размеров. 2. Впервые был исследован набор реполяризующих калиевых токов в миокарде перепела и их вклад в формирование электрической активности рабочего миокарда. В рабочих кардиомиоцитах присутствуют быстрый и медленный токи задержанного выпрямления IKr и IKs, а также транзиторный выходящий ток Ito. Ток Ito впервые был обнаружен в миокарде взрослых птиц. Ток IKr вносит значительный вклад в позднюю реполяризацию миокарда перепела, Ito опосредует раннюю реполяризацию. Ток IKs вносит незначительный вклад в позднюю реполяризацию миокарда и, по-видимому, выполняет роль реполяризационного резерва. 3. Впервые было показано, что в рабочем миокарде перепела экспрессируются и транслируются белки Kv11.1, Kv7.1 и Kv4.3, опосредующие токи IKr, IKs, и Ito в миокарде млекопитающих и являющиеся потенциальными молекулярными коррелятами каналов, опосредующих эти токи в миокарде перепела. 4. Впервые были описаны калиевые токи входящего выпрямления IK1 и IKACh в рабочем миокарде перепела. 5. Изучен и описан кальциевый ток в рабочих кардиомиоцитах перепела. Показано, что вход кальция в кардиомиоцитах взрослого перепела опосредован только кальциевым током L-типа, тогда как ток Т-типа отсутствует. 6. Впервые была произведена оценка емкости кальциевых депо саркоплазматического ретикулума рабочего миокарда взрослых птиц. Показано, что содержание кальция в СПР птиц значительно выше, чем таковое у млекопитающих. 7. Впервые было показано функциональное взаимодействие между сарколеммальными кальциевыми каналами и рианодиновыми рецепторами на мембране СПР в желудочковых кардиомиоцитах взрослого перепела. 8. Впервые было произведено оптическое картирование межвенной области сердца перепела и продемонстрировано расположение водителя ритма. 9. Впервые были получены кардиомиоциты пейсмекерного типа из области водителя ритма сердца взрослого перепела, и описаны их ключевые электрофизиологические характеристики. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".