Хроматин как бионаносистемаНИР

Chromatin as bionanosystem

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Кератины – семейство высокоспецифичных промежуточных филаментов, включающее 54 гена, расположенных в плотных кластерах на двух хромосомах. Локус 12q13.13 содержит гены кератинов II типа и ген кератина 18 I типа. Плотное расположение предполагает возможность существования комплексной регуляции экспрессии кератинов. Для поиска и исследования механизмов контроля локуса использовали клеточные культуры первичных кератиноцитов и дермальных фибробластов кожи человека. Данные клеточные типы были выбраны в качестве модельных объектов, поскольку обладают разной транскрипционной активностью в исследуемом локусе: первичные кератиноциты базального слоя эпидермиса продуцируют кератины 5/14 и 15, при дифференцировке они способны активировать экспрессию кератинов 1/10, а также специфических кератинов волосяного фолликула, в то же время для дермальных фибробластов экспрессия кератинов не характерна. Биологический материал 7 доноров (возраст от 22 до 38 лет) был предоставлен МНИОИ им. П.А. Герцена, филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России с информированного согласия. Для разделения дермального и эпидермального слоев кожу человека инкубировали в растворе диспазы, далее ферментировали до получения культуры единичных клеток. Дермальные фибробласты культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячей сыворотки и глутамина. Кератиноциты культивировали на среде CnT-07, предотвращающей их дифференцировку и стратификацию. Специфичность клеточных линий подтвердили методом иммуногистохимической детекции специфических маркеров и профиля экспрессии кератинов. В культуре эпидермальных кератиноцитов выявили экспрессию кератинов 5, 14 и 6. Цитометрический анализ показал, что данные белки экспрессирует 79,1±6%, 89,4±5,8% и 76,1±8% популяции кератиноцитов соответственно (здесь и далее данные представлены в качестве среднего значения по трём донорам). Мы не выявили экспрессию кератина 10 (2,6±3,6%), типичного для дифференцировки в шиповатый слой эпидермиса, и кератина 18 (8,5±7,1%), характерного для однослойных эпителиев. Набор кератинов соответствует базальному слою эпидермиса, за исключением кератина 6, экспрессия которого возникает при культивировании. Специфичность дермальных фибробластов подтвердили путем детекции маркеров S100A4 (88,1±14,4%), α-гладкомышечного актина (73,1±23,6%), фибронектина (88,1±14,8%) и виментина (88,9±9%). Мы не обнаружили исследуемых кератинов в культуре фибробластов, что также является их типичной характеристикой. Верифицированные линии использовали для получения библиотек C-TALE, на основе которых были впервые получены тепловые карты пространственной организации хроматина внутри локуса 12q13.13. Анализ транскрипционной активности локуса в исследуемых линиях провели методом РНК-секвенирования. Транскриптомный профиль подтвердил, что в дермальных фибробластах нет активной экспрессии в исследуемом локусе. В неактивном состоянии большая часть локуса находится в крупном петлевом домене, в котором содержатся все гены кератинов II типа, за исключением гена кератина 8, который с расположенным поблизости геном кератина 18 принадлежит соседнему домену. При сопоставлении полученных результатов с данными эпигенетического профилирования проекта ENCODE (клеточная линия NHEK) можно предположить, что основания петли (участки LCR1 и LCR2), изолирующей локус от прилежащих районов, обладают потенциальной энхансерной активностью, поскольку в них выявляется повышенное содержание эпигенетических меток, ассоциированных с регуляторными областями (в частности, Н3К27ас), и сайтов связывания архитектурного белка CTCF. Аналогичные характеристики демонстрируют области между генами кератинов 83 и 85 (область А), 85 и 84 (область В), а также между кератинами 74 и 72 (область С). Данные участки формируют 3 более мелких петлевых домена друг с другом, а также с краевыми областями (LCR1 и LCR2). Результаты РНК-секвенирования культуры первичных кератиноцитов показали активную транскрипцию генов кератинов 5, 6а и 6b, что подтверждает результаты иммуногистохимического анализа. Выявленные ранее петлевые домены сохраняются на карте пространственных взаимодействий исследуемого локуса. Между генами кератинов 5 и 6а и областями LCR1, LCR2 и В формируются специфические для кератиноцитов петли, что отображается на тепловой карте как новые контакты. С другими выявленными потенциальными регуляторными областями (А и С) гены кератинов контакты не формируют. Далее мы анализировали изменения частоты встречаемости пространственных контактов потенциальных регуляторных областей с активно транскрибируемыми генами кератинов при переключении экспрессии кератина 5 на кератин 1 в ходе эпидермальной дифференцировки. В эпидермисе клетки базального слоя, положительные по кератинам 5/14, активно пролиферируют и смещаются от базальной мембраны, формируя шиповатый слой, для которого характерна экспрессия пары кератинов 1 и 10. В культуральных условиях невозможно получить изолированную популяцию кератин 1/10 положительных клеток, поэтому мы в своей работе предпочли использовать суспензию выделенных непосредственно из кожи первичных эпидермальных кератиноцитов базального и шиповатого слоев. В эпидермисе экспрессия кератина 14 снижается от базальной мембраны по мере клеточной дифференцировки. В то же время экспрессия кератина 10 типична только для шиповатого слоя, и не выявляется в герминативных клетках базального слоя. Суспензию клеток, полученную после диссоциации эпидермиса, иммуногистохимически окрашивали антителами против кератина 14 базального слоя эпидермиса и кератина 10 шиповатого слоя. Цитометрический анализ показал наличие трех субпопуляций – положительные только по кератину 14, только по кератину 10 и двойные положительные клетки. Субпопуляции кератиноцитов базального слоя (кератин 14+/10-) и шиповатого слоя (кератин 14-/10+) были отобраны путем клеточного сортинга и использованы для построения карты пространственных взаимодействий локуса 12q13.13. Было обнаружено, что гены специфических кератинов – кератина 5 для базального слоя и кератина 1 для шиповатого – контактируют с областями LCR1, LCR2 и B, что подтверждает регуляторные функции этих участков. Интересно, что в базальном слое ген кератина 5 контактирует со всеми потенциальными регуляторными областями с примерно одинаковой интенсивностью, в то время как в шиповатом слое пространственное взаимодействие кератина 1 более выражено с LCR2, чем с LCR1 и областью В. Эти результаты указывают, что для активации транскрипции гена кератина 5 необходимы контакты со всеми тремя регуляторными элементами, в то время как для гена кератина 1 основное значение имеет контакт с LCR2. Мы сравнили карты пространственных взаимодействий для кератиноцитов базального слоя до и после культивирования. Наиболее заметным отличием являются изменения в конформации локуса, ассоциированные с экспрессией в культуре кератина 6. Ген кератина 6а в культивированных кератиноцитах контактирует с LCR1 и LCR2. В кератиноцитах, выделенных из эпидермиса, данные контакты отсутствуют. Также в кератиноцитах до культивирования интенсивность взаимодействий между областями B и LCR1 значительно ниже, чем на тепловой карте, полученной для клеточной культуры. Специфичность этого петлевого домена для культуральных условий прослеживается и на других тепловых картах: он отсутствует у кератиноцитов шиповатого слоя, полученных из кожи человека, однако выявляется у культивированных дермальных фибробластов. Мы расширили спектр клеточных линий для построения карт пространственных взаимодействий, чтобы оценить, насколько специфичной является конформация локуса 12q13.13. Использовали линию иммортализованных кератиноцитов человека HaCaT, в которой профиль экспрессии кератинов аналогичен таковому в культуре эпидермальных кератиноцитов, и линию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека Kyoto, в которых данный локус транскрипционно не активен. Поскольку данные эксперименты не были запланированы в первый год исследования, все нижеприведенные предварительные результаты получены только для одной биологической повторности. На картах пространственных взаимодействий хроматина в локусе 12q13.13 в обеих дополнительных линиях наблюдаются контакты, выявленные ранее в линии дермальных фибробластов, включая контакт между областями В и LCR1. Для клеток HaCaT, как и для нормальных эпидермальных кератиноцитов, характерна активная транскрипция кератинов 5 и 6а. Однако, в клетках НаСаТ данные гены чаще взаимодействуют с областью LCR2, чем с LCR1 или В, чем у эпидермальных кератиноцитов, где данные контакты формируются с одинаковой частотой. Результаты РНК секвенирования ИПСК подтвердили отсутствие транскрипционной активности внутри исследуемого крупного петлевого домена и выявили высокий уровень экспрессии кератинов 8 и 18, хотя они и не детектируются на белковом уровне. Ни одна из регуляторных областей локуса не имеет контактов с этими генами, что подтверждает предварительное предположение о том, что данные гены локализованы в соседнем домене и имеют отдельную регуляцию. Другим интересным результатом, полученным с использованием ИПСК, является снижение частоты контактов LCR1 и LCR2, в то время как контакт области В с LCR2 остается стабильным. Вероятно, этот петлевой домен является наиболее конститутивным в локусе 12q13.13. Суммируя полученные данные можно заключить, что благодаря новейшему высокоточному методу C-TALE мы смогли впервые построить карты пространственных взаимодействий хроматина в локусе 12q13.13 для 6 клеточных линий с разной степенью экспрессии кератинов. Сравнение тепловых карт позволило выявить 5 областей, формирующих контакты в локусе 12q13.13. Области LCR1 и LCR2 замыкают большую часть локуса в отдельный петлевой домен, обладающий общими регуляторными элементами, которым не подчиняются гены кератинов 8 и 18. Участки LCR1, LCR2 и В являются регуляторными, контакт с ними ассоциирован с высоким уровнем транскрипции. Важнейшим регуляторным элементом является LCR2, контакт с ним активных промоторов выявляется в первичных, культивированных и иммортализованных кератиноцитах линии HaCaT. Сильные пространственные взаимодействия с областями B и LCR1 характерны только для активно транскрибируемых генов в первичных и культивированных базальных кератиноцитов, что может коррелировать с их стволовым статусом и высоким дифференцировочным потенциалом. Контакты регуляторных областей LCR1, LCR2 и В друг с другом также имеют разную стабильность. Петля, формируемая LCR2 и областью В, является наиболее консервативной, так как выявляется во всех исследованных линиях. Контакт между LCR1 и областью В проявляется только в условиях культивирования. Контактные взаимодействия между LCR1 и LCR2 являются более слабыми в плюрипотентных клетках в сравнении с остальными культурами. Размыкание крупного петлевого домена, содержащего большую часть локуса, в ИПСК, по-видимому, не связано с отсутствием транскрипционной активности генов кератинов, так как для линии дермальных фибробластов, характеризующейся таким же низким уровнем транскрипции в локусе, данное пространственное взаимодействие сохраняется. Анализ формирования этого домена будет проведен на второй год исследования на модели эпидермальной дифференцировки ИПСК. Области А и С формируют «структурные» петли, сохраняющиеся во всех исследуемых линиях, но не контактирующие с активно транскрибируемыми генами. При этом области А, В и С находятся в кластерах генов кератинов, специализированных для волосяного фолликула, что позволяет рассчитывать на раскрытие функции этих областей на более поздних этапах проекта. Результаты первого года работы были представлены на международной конференции «Society for Developmental Biology 79th Annual Meeting» в виде стендового доклада.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Опубликованные ранее данные Hi-C выявили несколько уровней пространственной организации прокариотических геномов: компартменты, макродомены и CIDs (chromosome interaction domains). Для аннотирования последних необходимо иметь: (i) карту контактов с высоким разрешением, обычно не менее 15 т.п.н., и (ii) подходящий алгоритм для поиска доменов. Одно из ограничений заключается в том, что большинство алгоритмов поиска были разработаны для эукариот, чьи домены несколько иначе выглядят на контактных картах. Поэтому мы стремились провести всесторонний тест доступных алгоритмов поиска, чтобы определить их потенциальное применение к прокариотическим данным. Для сравнительного анализа мы использовали данные 3C-seq из пяти независимых исследований, в которых использовали разное количество образцов и протоколы с различными ферментами рестрикции. Для того, чтобы иметь возможность непосредственно сравнивать результаты и облегчить процедуру поиска CID, ко всем образцам был применен единый конвейер обработки данных. Мы сравнили производительность 29 алгоритмов поиска CID, используя две метрики: JI (Jaccard Index), которая измеряет нормализованное перекрытие между аннотированными границами доменов, и MoC (Measure of Concordance), которая вычисляет общее сходство профилей CID из двух сегментаций генома. В целом, профили CID между биологическими повторностями оказались довольно стабильными и были идентифицированы всеми тестируемыми алгоритмами. Сходство аннотаций было очень высоким для всех алгоритмов, кроме HiCExplorer и ClusterTAD (медиана MoC 0,71). Во всех наборах данных прокариот lavaburst.modularity, HiCseg, Индекс инсуляции и Индекс направленности показали самую высокую схожесть профиля границ (JI > 0,55) и самую высокую вопроизводимость (MoC > 0,83) между биологическими повторностями в рамках одного и того же исследования. Также были определены алгоритмы, демонстрирующие наименьшую схожесть профилей CIDs в биологических повторностях: deDoc, GMAP, IC-Finder и TADtree. Чтобы оценить схожесть профилей, определенных различными алгоритмами для одного и того же набора данных, мы подсчитали, как часто границы CID, аннотированные каждым из алгоритмов, идентифицировались другими алгоритмами (процент общих границ). В среднем все алгоритмы имели сопоставимую долю общих границ в парных сравнениях (85%), однако большинство из них, как правило, были общими только для двух-четырёх алгоритмов. Среди всех алгоритмов IC-Finder, lavaburst.dispersion и EAST имели самую высокую долю уникальных границ, т.е. таких, которые не были обнаружены ни одним другим способом, в то время как TopDom, OnTAD и TADpole имели самую высокую долю общих границ (> 50% были обнаружены более чем пятью другими алгоритмами). Мы также рассмотрели внутренние свойства аннотированных доменов. Количество и размеры CID, аннотированных различными алгоритмами, значительно различались при сравнении биологических повторностей. Например, для E.coli EAST аннотировал в среднем 225 доменов на повторность, в то время как TADpole идентифицировал в среднем только семь. Для всех наборов данных Arrowhead аннотировал наименьшее количество CID (всего 66), в то время как TADbit аннотировал больше всего (704). Средние размеры CID для обеих карт контактов C.crescentus с разрешением 10 т.п.н. варьировались от 40 т.п.н. для CaTCH и MrTADFinder до 610 т.п.н. для GMAP. Более того, некоторые инструменты (GMAP, TADpole и HiCExplorer) систематически аннотировали более крупные CID, чем другие. Примечательно, что в то время как некоторые разметки CID охватывали большую часть генома (например более 90% покрытия с помощью lavaburst.модульность, HiCseg, Инлекса инсуляции, Индекса направленности, TADbit, Chromosight, TopDom, SpectralTAD, chromoR и TADpole), почти треть алгоритмов не давала непрерывного профиля CID (например, менее 40% покрытия генома быдо получено с использованием CaTCH, HiCExplorer, Armatus, Arrowhead, CHDF, IC-Finder и EAST). Мы дополнительно оценили время работы каждого алгоритма, используя карты контактов с разрешением 5 и 10 т.п.н. Время работы большинства инструментов не превышало 30 сек для карты контактов размером 5 т.п.н. и 5 сек для карты контактов размером 10 т.п.н. Чтобы исследовать влияние покрытия ридами и разрешения на поиск доменов, мы сгенерировали «искусственные» контактные карты, используя объединенный набор данных E. coli, сохраняя диапазон числа контактов и разрешений из реальных данных. Все инструменты, кроме Arrowhead, CHDF и spectral, показали высокое соответствие границ CID, аннотированных при различных покрытиях. С другой стороны, некоторые, но не все инструменты (например lavaburst.corner, lavaburst.modularity и Индекс направленности) стабильность аннотации CIDs и при разных разрешениях карт. В целом, воспроизводимость разметки CID для каждого алгоритма была выше при различной глубине покрытия контактной карты (медиана MoC 0,76), чем при различных разрешениях контактной карты (медиана MoC 0,46). Lavaburst.modularity и lavaburst.corner продемонтсрировали наилучшие показатели по глубине покрытия и разрешениям соответственно. В целом, lavaburst. modularity, HiCseg, Индекс инсуляции и Индекс направленности продемонстрировали надежное картирование CID в выбранном диапазоне глубин покрытия и разрешений, аналогично их работе с наборами реальных Hi-C данных прокариот. Алгоритмы поиска CID должны демонстрировать стабильность средних размеров CID при различной глубине покрытия, а также обратную зависимость между средним размером CID и разрешением карты. Поэтому мы классифицировали все инструменты в соответствии с этими критериями, рассчитав размеры их аннотированных доменов. Как и ожидалось, аннотации большинства алгоритмов изменялись предсказуемо в ответ на изменения как в покрытии карт, так и в разрешении. Однако разметки ряда алгоритмов (HiCExplorer, lavaburst.dispersion, ClusterTAD, Arrowhead, TADtree и TADpole) менялись хаотично, без видимой системы. В целом, наши результаты демонстрируют, что некоторые из алгоритмов поиска CID, которые мы сравнили, нечувствительны к покрытию и разрешению карты контактов, что делает их подходящими для использования с контактными картами прокариот с различной глубиной секвенирования и разрешением. Применительно к исследованию точеных взаимодействий между регуляторными элементами генома принципиальным ограничением большинства конвенциональных С-методов является невозможность дискриминации между альтернативными парными взаимодействиями, реализующимися в разных индивидуальных клетках популяции, и одновременными контактами между тремя, четырьмя и бОльшим числом партнёров в одной и той же клетке. В обоих случаях на карте контактов будет наблюдаться система петель («розетка»), зачастую с интенсивностью сигнала в пятнах контактов, которая никак не будет зависеть от геномного расстояния между основаниями петли. Эта неопределённость может быть разрешена микроскопическими методами, позволяющими визуализировать короткие геномные фрагменты. В данном проекте мы оптимизировали условия проведения гибридизации in situ по протоколу Oligopaint FISH. Был заказан синтез 100 олигонуклеотидов, перекрывающих 10 т.п.н. в суперэнхансере и гене KRT5 локуса кератиновых генов человека на хромосоме 12. За основу был взят протокол из лаборатории Чао-тинг Ву (Йельская медицинская школа, Current Protocols in Molecular Biology 14.23.1-14.23.20, January 2014), включающий в себя прогрев препарата ядер в 50% формамиде при 90 и при 60 градусах перед гибридизацией. Многократное варьирование условий денатурации, времени и температуры гибридизации, а также отдельных шагов подготовки препарата не позволили добиться положительного результата. Варьирование температуры и условий гибридизации никак не влияли на качество препаратов: во всех случаях имело место равномерное окрашивание всего ядра. То же самое мы наблюдали и со вторым пулом зондов, подобранных к гену KRT5. Чтобы преодолеть эти трудности мы приняли решение самостоятельно приготовить зонды для гибридизации. С этой целью были ПЦР-амплифицированы три района из локуса кератиновых генов, каждый длиной порядка 15 т.п.н.: chr12:52143089-52159019 (суперэнхансер на 5’-границе локуса), chr12:52514650-52530365 (ген KRT5) и chr12:52865087-52881662 (суперэнхансер на 3’-границе локуса). Каждый участок был амплифицирован двумя фрагментами примерно равного размера, которые были клонированы в Т-вектор. Далее, выделенные из бактериальных культур конструкты метили биотином (выявление антителами, меченными Cy3) или Atto647N (прямая метка) посредством ник-трансляции с модифицированными нуклеотидами. Непрямое мечение даёт несколько более шумные результаты, но тем не менее качества, вполне приемлемого для дальнейшего использования. Таким образом, нами был отработан протокол, позволяющий надёжно визуализировать в ядре геномные фрагменты длиной порядка 10-15 т.п.н. Использование его позволило установить, что примерно в 15% случаев ген KRT5 вовлекается в тройственный комплекс взаимодействий с обоим суперэнхансерами локуса кератиновых генов.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа: Согласно плану, в 2023 году мы провели эксперименты по картированию топологии генома термофильной археи Thermofilum adornatum на разных стадиях роста культуры (ранняя экспоненциальная, поздняя экспоненциальная, стационарная). Для этого мы использовали модифицированный высокопроизводительный протокол фиксации конформации хромосомы, адаптированный для работы с культурами прокариот. Клетки в среде роста фиксировали 3% формальдегидом в течение 10 минут, после чего дважды отмывали однократным буфером PBS. Затем клеточные стенки разрушали с использованием механического гомогенизатора, и пермеабилизированные таким способом клетки использовали для приготовления библиотеки Hi-C. Материал выдерживали в изотоническом растворе с неионными детергентами (Triton X-100, NP-40), после чего солюбилизировали ДНК-белковые комплексы в 0.3% SDS, одновременно удаляя из них значительную часть нефиксированной белковой массы, что в дальнейшем облегчает работу ферментов. В подготовленных таким способом образцах ДНК фрагментировали частощепящей рестриктазой HpaII (сайт узнавания C^CGG), концы рестриктных фрагментов заполняли с использованием биотинилированного дЦТФ, и лигировали in situ. После этого ДНК очищали, удаляли биотинилированные нуклеотиды с концов рестриктных фрагментов, не подвергшихся лигированию, и фрагментировали ДНК ультразвуком. Молекулы, содержащие точки лигирования, очищали на магнитных частицах, конъюгированных со стрептавидином, затем проводили репарацию концов, лигирование адаптеров Illumina и амплифицировали полученную библиотеку с праймерами, комплементарными адаптерам. Библиотеку секвенировали на платформе Illumina парными ридами длиной 150 нуклеотидов. Данные секвенирования обрабатывали с использованием пакета программного обеспечения distiller (https://github.com/open2c/distiller-nf). Основные этапы обработки включали картирование ридов на референсный геном, фильтрацию неуникальных картирований, удаление пар ридов с одного рестриктного фрагмента и ПЦР-дупликатов. Процессированные данные Hi-C представляли в виде матриц, визуализируемых тепловыми картами, на которых интенсивность цвета отражает частоту контактов между удалёнными геномными фрагментами. Топология генома Thermofilum adornatum значительно различается на разных стадиях роста культуры. В ранней экспоненциальной присутствует ярко выраженная компартментализация, причём только в левом (относительно ориджина репликации) плече хромосомы. Здесь видны два региона, формирующие компартментоподобную структуру. Принимая во внимание ранее опубликованные данные по топологии генома прокариот, можно предположить, что её наличие объясняется выраженно неравномерным распределением активно транскрибируемых генов в этой области генома. В ранней экспоненциальной фазе отсутствует побочная диагональ, характерная для Hi-Cкарт прокариотических организмов. Эта структура формируется как результат загрузки на ориджин репликации и последующего движения вдоль хромосомы SMC-комплексов, которые складывают хромосому в веретонообразную спираль. Побочная диагональ в геноме Thermofilum adornatum начинает формироваться на стадии поздней экспоненты. Тогда же происходит частичное разрушение описанной выше компартментой структуры. Наиболее выражена побочная диагональ в стационарной фазе роста, где она является единственной топологической структурой генома Thermofilum adornatum. На малых масштабах расстояний на всех стадиях роста хромосома Thermofilum adornatum разделена на хорошо выраженные топологические (контактные) домены. Судя по всему, в их границах находятся наиболее активно транскрибируемые гены (так называемые гены «домашнего хозяйства», кодирующие рибосомальные белки, основные ферменты метаболизма, компоненты транскрипционной машинерии и т.д.). Именно поэтому топологические домены в отличие от компартментов и побочной диагонали персистируют на всех стадиях роста культуры. Кроме выполнения экспериментов, заявленных в изначальном плане, в 2023 году мы провели дополнительную работу в части исследования возможности редактирования 3D генома клеток человека с использованием химерных белков, включающих фрагменты архитектурного белка CTCF. Мы провели анализ топологи локуса HOXD в клетках К562 на фоне привлечения транкированных форм архитектурного белка CTCF к точке локуса, в которой CTCF в норме не связывается. Привлечение осуществляли посредством слияния фрагментов CTCF с Cas9, лишённой нуклеазной активности (dCas9). В экспериментах использовали N-концевой домен CTCF (N-dCas9), а также N-концевой домен и 2 или 7 доменов «цинковые пальцы» (N+2ZF-dCas9 и N+7ZF-dCas9, соответственно). Клетки электропорировали смесью экспрессионного конструкта для химерного белка и плазмиды, кодирующей гидовые РНК. Электропорацию проводили на приборе Neon Transfection System в режиме 1600 В/20 мс/2 пульса. После электропорации клетки выдерживали сутки в среде без антибиотика для повышения выживаемости, после чего переводили в полную среду роста. Через 2-3 суток после электропорации оценивали число клеток, экспрессирующих химерный белок, используя проточную цитофлуорометрию (dCas9 и фрагменты CTCF клонированы в одной рамке считывания с GFP). В среднем 20-30% выживших послеэлектропорации клеток экспрессировали химерный белок. Такое относительно небольшое число положительных клеток не является препятствием для получения качественных данных, поскольку в этих экспериментах мы планировали наблюдать возникновение петли в том месте генома, где её в норме нет, а для этого достаточно, чтобы петля возникла буквально в нескольких процентах клеток популяции. После оценки эффективности электропорации контрольные и экспрессирующие химерный белок клетки использовали для приготовления С-TALE библиотек с обогащением продуктов лигирования из локуса HOXD. Полученные данные говорят о том, что использованные нами химерные белки имеют разную способность к формированию хроматиновых петель. Привлечение на хроматин N+2ZF-dCas9 позволило сформировать выраженное взаимодействие с другой точкой локуса, расположенной в 3’-направлении и содержащей слабый пик связывания эндогенного CTCF. Привлечение N-dCas9 также позволило сформировать хроматиновую петлю, а привлечение химеры N+7ZF-dCas9 не привело к образованию петли между точкой привлечения и каким бы то ни было другим участком в пределах локуса. Принимая во внимание тот факт, что «цинковые пальцы» 5-7 используются CTCF для связывания с коровой частью мотива, можно предположить, что химерный белок N+7ZF-dCas9 связывается с эндогенными сайтами CTCF в геноме, что создаёт конкуренцию для ДНК-связывающего модуля dCas9 и снижает эффективность привлечения химеры к заданной точке в пределах локуса HOXD.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:
7 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. Хроматин как бионаносистема
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".