ИСТИНА

Критическое значение для выживания организмов имеет репарация ДНК, т. е. исправление химических повреждений и разрывов ДНК, образовавшихся в процессе нормального биосинтеза или в результате воздействия химических и физических факторов.Наиболее интересной с точки зрения химического механизма является (6-4) фотолиаза, осуществляющая репарацию наиболее цитотоксичных фотопродуктов ДНК. Фотолиазы относятся к редкому классу природных соединений, которые используют энергию электромагнитного излучения для катализа. В основе функционирования фотолиаз лежит реакция фотоиндуцированного межмолекулярного переноса электрона, имеющая фундаментальное значение в биоэнергетике. Для избежания дальнейших повреждений структуры ДНК при восстановлении (6-4) пиримидин-пиримидон фотопродуктов фермент должен восстановить связь C-O до расщепления связи С-С между пиримидиновыми основаниями, что возможно достигается посредством синхронизации переноса электрона и протона с фермента на белок. Несмотря на активное изучение механизма функционирования (6-4) фотолиазы с использованием наиболее современных экспериментальных и расчетных методов, химический механизм репарации окончательно не был установлен. Для разрешения существующих на сегодняшний день противоречий в понимании механизма действия (6-4) фотолиазы, наш проект предлагает подходы, основанные на использование многомасштабного моделирования. Новизна нашего подхода состоит в использовании в качестве основного критерия надежности моделирования сравнение рассчитанных скоростей переноса электрона между ферментом и ДНК с опубликованными экспериментальными данными. На основании нашего опыта изучения фотоактивных белков в рамках проекта будут разработаны методы оценки скоростей переноса электрона. Взаимодействия в активном центре фотофермента будут оцениваться на уровне высоко-точных квантово-химических расчетов с учетов влияния сложного электростатического окружения активного центра в комплексе фотолиазы в ДНК, динамика которого тоже будет учтена с использованием методов классической динамики. В рамках разработанных подходов будут рассмотрены все предложенные в литературе схемы многостадийной реакции репарации (6-4) фотопродуктов. Использование точных многоконфигурационных квантово-химических расчетов позволит предсказывать спектральные свойства интермедиатов. На основе систематических исследований и сравнений с экспериментальными данными будет предложен химический механизм реакции, свободный от существующих на сегодняшний день противоречий. Также в рамках проекта методами классической молекулярной динамики будет проведен анализ взаимодействий, отвечающих за специфическое связывание фермента фотолиазы с поврежденным участком ДНК.

The repair of DNA chemical damage or strand breaks occurring during normal biosynthesis or resulting from the exposure to chemical and physical agents is critical for the survival of organisms. Comprehensive studies of various aspects of DNA repair is an important research area at the intersection of biochemistry, biophysics and molecular biology. In 2015, the Nobel Prize in Chemistry was awarded for studies of DNA repair, including investigations of DNA photolyases. DNA photolyases belong to a rare class of natural compounds that utilize the energy of electromagnetic radiation for catalysis. Upon UV-vis light absorption, the photolyases reverse the main DNA photoproducts, cyclobutane dimers and (6-4) pyrimidine-pyrimidone photoproducts. The chemical basis for the function of photolyases is photoinduced electron transfer – a reaction of fundamental importance in bioenergetics. The repair catalyzed by the photolyases is characterized by high quantum yield and high chemical selectivity, and hence, these enzymes are considered as prototypes for artificial photoenzymes and optogenetic switches. The molecular mechanism by the (6-4) photolyase has been extensively investigated over years since the enzyme repairs cytotoxic (6-4) pyrimidine-pyrimidone DNA photoproducts. The (6-4) photolyase cleaves the interbase C-C bond only after restoring the C-O bond in the 3’ base of the (6-4) photoproduct, which ensures that no further DNA damage occurs coursed by the photoenzyme function. The question of how the coordination of the elementary steps by the enzyme is achieved has been a subject of several recent investigations. Most of the studies proposed that proton transfer from the enzyme to the DNA accompanies the initial electron transfer, yet these studies suggested differing repair pathways. Several scientific groups worldwide proposed conflicting mechanism of the repair. Hence, the exact sequence of chemical steps affording the (6-4) photoproduct repair is not established despite the availability of high-resolution crystal structures, time-resolved spectroscopic data and numerous computational studies. To resolve the currently existing controversies, we propose a study relying on multiscale modeling approaches. The novelty of our study lies in comparison of the calculated electron transfer rates for all suggested repair pathways with the published experimentally determined rates. Methods for assessing electron transfer rates will be developed on the basis of our experience in studying photoactive proteins. Interactions in the active site of the photoenzyme will be evaluated by high-level multiconfigurational quantum-chemical methods; the influence of the electrostatic environment of the active site will be also taken into account by methods of classical molecular dynamics. All schemes of the (6-4) of photoproduct repair discussed in the literature will be evaluated using the protocol developed for computations of electron-transfer rates. The use of accurate multiconfigurational quantum-chemical methods will also enable predicting the spectral properties of the repair intermediates. By means of a systematic comparison, a chemical mechanism will be proposed which will be free from the contradictions existing today. In addition, using extensive molecular dynamics simulations we will identify protein residues assisting specific binding of the enzyme to the DNA region containing photoproducts.

Первый этап: Результаты МД моделирования комплексов фотолиаза-ДНК до и после реакции репарации. Сравнение координат реакции репарации при участии нейтрального и протонированного остатка гистидина 365, выводы относительно роли гистидина 365 в каталитическом механизме (6-4) фотолиазы. Получение оценок скоростей реакции по методу Уоршела для прямого фотохимического и обратного термического переноса электрона, оценка их точности, сравнение с экспериментальными данными. Второй этап: 1) Уточнение и оптимизация протоколов комбинированных КМ и МД расчетов оценок скорости переноса электрона в макромолекулярном комплексе фотофермента с ДНК. Для моделей (6-4) фотолиазы с нейтральным и протонированным His365 будет проведено сравнение скоростей фото-индуцированного переноса электрона. Такие расчеты требуют МД моделирование фото-возбужденного флавина и оценки дифференциальных эффектов взаимодействия макромолекулярного окружения с восстановленным флавином в основном и возбужденном состоянии. 2) Для обоснования упрощенного анализа скоростей фотоиндуцированного переноса электрона планируется проведение расчетов электронных спектров в рамках гибридными КМ/ММ моделей. Такие результаты позволят оценить подстройку энергий возбуждения восстановленного флавина за счет электростатических эффектов макромолекулярного окружения и растворителя. 3) Для дальнейшего изучения реакции репарации с участием нейтрального His365, необходимо провести расчеты для оценки возможного снижения энергии переноса OH-группы в радикале фотопродукта при взаимодействии с белком. Сравнение энергий радикальных интермедиатов (6-4) фотопродукта будет проведено в рамках КМ и КМ/ММ расчетов (а также КМ/ММ-МД расчетов, если удастся подобрать подходящую координату реакции). Сравнение моделей, в которых искомая разница энергий изменяется, позволит определить, какие факторы обеспечивают стабилизацию радикалов фотопродуктов и соответствующий каталитический эффект. 4) Сравнение энергий протонированного фотопродукта, протонированного радикала фотопродукта и оксетана фотопродукта будет проведено в различных молекулярных моделях (при подборе состояний флавина и His365, обеспечивающем прямое сравнение энергий) будет проведено в рамках КМ и КМ/ММ-МД подходов. Результаты расчетов послужат установлению факторов, определяющих изменения сродства к электрону и протону у (6-4) фотопродукта при взаимодействиях с белком. Полученные оценки позволят в том числе проанализировать и обсудить предложенный в литературе вариант реакции репарации, зависящий от последовательного поглощении двух фотонов. Результаты позволят сделать вывод о возможной каталитической роли протонированного His365. 5) На основании полученных оценок скоростей реакций переноса электрона и расчетов энергий вдоль наиболее вероятных координат реакции репарации будет проведено сравнение механизмов репарации ДНК (6-4 фотолиазой), предложенных в литературе. Анализ всех стадий процесса с привлечением результатов многомасштабного моделирования позволит опрелелить последовательность химических превращений, в наибольшей степени согласующуюся с всем комплексом экспериментальных данных.

В наших статьях, ранее опубликованных в высокорейтинговых журналах, был рассмотрен ряд вопросов, имеющих непосредственное отношение к моделированию реакции репарации (6-4) фотопродукта фотолиазой. Был проведен анализ кристаллографических данных, полученных для комплекса ДНК с (6-4) фотолиазой. В радикальном состоянии 6-4 фотопродукта были рассмотрены реакции образования связи C-O и разрыва связи C-C и влияние протонирования активного центра, в частности присутствия протонированного гистидина на энергии репарации. Выводы, сделанные в наших работах, позволяют предложить механизм репарации, рассматривающий перенос электрона между фотолиазой и ДНК и перенос протона в самом фотопродукте. Оценка такого механизма на предмет соответствия экспериментальным данным будет проведена в рамках заявленных исследований. Наши опубликованные работы также посвящены использованию гибридных моделей КМ/ММ для расчета возбужденных состояний в комплексе фотолиаза ДНК, изучению механизма модулирования редокс потенциала кофактора ФАД остатками белка в фотолиазе, и оценке устойчивости интермедиата оксетена, который возможно образуется как в ходе реакции репарации так и в ходе реакции образования (6-4) фотопродукта. Кроме того, нами была проведена разработка параметров силового поля CHARMM для моделирования основных фотопродуктов ДНК. В рамках предварительных расчётов к предлагаемому проекту, было проведено сравнение реакций репарации для циктобутанового димера и (6-4) фотопродукта с использованием XMCQDPT2 расчетов. Была решена задача подбора пространства активных орбиталей и количества рассматриваемых состояний для проведения согласованных расчетов спектра возбужденных состояний для существенно отличающихся геометрий, составляющих координату реакции репарации. Проведенные расчеты указывают на существенные недостатки модели, не учитывающей взаимодействие донора и акцептора электрона с их молекулярным окружением, для предсказания моментов неадиабатических переходов.

Первый этап: 1. Проведена оценка влияния макромолекулярного окружения на энергетические характеристики процесса переноса электрона. Взаимодействие донора и акцептора электрона с окружением в комплексе ДНК-фотолиаза было рассмотрено для исходного состояния восстановленного флавина и для фотоиндуцированной радикальной пары. Полученные оценки позволяют установить, что присутствие нейтрального или протонированного His365 влияет на рекомбинацию первичной радикальной пары. Показано, что окружения увеличивает свободную энергию переноса электрона. В случае протонирования радикала фотопродукта His365, макромолекулярное окружение скорее стабилизирует радикальную пару. В целом, результаты указывают на предпочтительную стабилизацию нейтральных форм фотопродукта (6-4TT и 6-4TTH•) в макромолекулярном комплексе 6-4 фотолиазы с фрагментом ДНК. 2. Были получены оптимизированные геометрии, моделирующие стадии реакции репарации (6-4) фотопродукта для случаев нейтрального и протонированного His365. В случае участия нейтрального His365, вероятной представляется перегруппировка первичного радикала за счет переноса OH-группы. Для протекания такой реакции в фотоферменте необходимо снижение барьера реакции, либо за счет стабилизации перегруппированного радикала, либо дестабилизации (активации) первичного радикала. В присутствии протонированного His365, происходит сопряженный перенос протона и электрона, что приводит к образованию протонированного радикала фотопродукта 6-4TTH•. В рассмотренной кластерной модели энергия радикальной пары ФАДH• и 6-4TTH• близка к энергии исходных реагентов и протонированного фотопродукта ФАДH- и 6-4TTH+. Для протекания реакции репарации по данному пути необходима подстройка сродства к электрону и протону фотопродукта за счет взаимодействий в белком и макромолекулярным окружением. 3. Расчеты энергий возбужденных электронных состояний показали, что энергии электронных возбуждений существенным образом зависят от состава КМ кластера (или КМ подсистемы). Так, присутствие протонированный фосфатной группа существенно повышает энергию радикальной пары. Полученные энергии предсказывают образование долгоживущей радикальной пары флавин - фотопродукт, рекомбинация которой энергетически невыгодна. Стабилизация нейтрального радикала фотопродукта была обнаружена во всех рассмотренных кластерных моделях. По результатам расчетов возбужденных оценивали матричные элементы неадиабатической связи (Vel). Для реакций рекомбинации полученные оценки меняются от 1 до 15 см-1. Некоторое увеличение Vel происходит с определенными изменениями геометрии. 4. Был опробован метод оценки скоростей переноса электрона, комбинируя результаты МД моделирования и XMCQDPT2-CASSCF расчетов. Скорость рекомбинации в модели с нейтральным His365 практически не снижается из-за энергетического барьера и лимитируется квадратом матричного элемента неадиабатической связи. Влияние протонированного His365 замедляет реакцию обратного переноса электрона. Второй этап: