![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на формирование наборов интегральных индикаторов патологических процессов в организме человека для их ранней диагностики и мониторинга при социально- значимых заболеваниях путём установления взаимосвязи этих процессов на молекулярном, клеточном и тканево-организменном уровнях. Заявляемое в проекте исследование, основанное на изучении механизмов изменения и связи фотофизических параметров, позволит сформировать столь необходимый практической медицине научно-обоснованный набор интегральных индикаторов, обладающих высокой специфичностью для выявления таких социально значимых заболеваний как артериальная гипертензия, сахарный диабет, метаболический синдром. Оно будет выполнено на основе комплексного использования таких оптических методов диагностики и визуализации, как флуоресцентная спектроскопия, рефлектометрия диффузного отражения света, дифрактометрия, капилляроскопия и пр., в разработке которых участники проекта приняли непосредственное участие. Эти методы обладают рядом преимуществ в сравнении с другими подходами – возможностью работы как на уровне единичных молекул (белков, метаболитов), так и на уровне клеток и органов, экспрессностью (часто в реальном времени) и недеструктивностью анализа. В основе нашего подхода лежит высокая чувствительность измеряемых фотофизических параметров к патологическим изменениям. Значительный научный задел коллектива исполнителей в предметной области проекта позволяет рассчитывать на успешное решение поставленных задач. В отличие от работ, исследующих сопутствующие патологическим процессам биохимические и биофизические изменения по отдельности, в предлагаемом проекте решается задача разработки и внедрения в практическую медицину наборов интегральных индикаторов социально значимых заболеваний (артериальная гипертензия, сахарный диабет, метаболический синдром) для их ранней диагностики и мониторинга.
The project is directed at the formation of sets of integral indicators of pathological processes in human organism for their early diagnostics and monitoring of the diseases of social importance by means of determining the interrelation of the pathological processes on molecular, cellular and tissue-organism levels.The proposed research based on the study of the mechanisms of photophysical parameters will allow for the formation of sets of highly specilic integral indicators for educing such diseases of social importance as arterial hypertension, diabetes mellitus, methbolic syndrom. These indicators are highly needed for practical medicine. The research will be performed on the basis of complex application of such optical techniques of diagnostics and visualization as fluorescence spectroscopy, reflectometry of diffuse reflected light, diffractometry, capillaroscopy et al. These techniques were designed and developed with direct participation of the applicants. They have a number of advantages over other approaches, i.e. possibility of operation on the level of both single molecules (proteins, methabolites) and cells and tissues; rapidity (often in real time) and nondestructiveness of the analyses. Our approach is based on high sensitivity of the measured photophysical parameters to pathological alterations. Significant scientific reserve of the applicants in the subject area of the project allows for expecting a successful solution of the tasks set. Unlike the works studying the biochemical and biophysical alterations concomitant to the pathological processes separately, in this project, we shall solve the problem of designing and introduction into paractical medicine of the sets of integral indicators of the diseases of social importance (arterial hypertension, diabetes mellitus, methbolic syndrom) for their early diagnostics and monitoring.
Будут сформированы наборы интегральных индикаторов патологических состояний организма для их ранней диагностики и мониторинга путём установления взаимосвязи патологических процессов на молекулярном, клеточном и тканево-организменном уровнях. Главным образом это касается таких социально значимых заболеваний как артериальная гипертензия, сахарный диабет, метаболический синдром. Распространенность этих заболеваний, являющихся одной из основных причин повышенной смертности, в нашей стране и в других развитых странах мира стремительно увеличивается. Поэтому разработка и внедрение в клиническую практику таких индикаторов представляет собой значимую научную и социально значимую задачу. Полученные результаты планируется обнародовать в виде монографии, серии статей в высокорейтинговых научных изданиях и серии докладов на престижных научных конференциях.
1. Развит метод нелинейной флуориметрии, позволяющий определять фотофизические параметры молекул и скорости межмолекулярного переноса в локализованных донорно-акцепторных системах, который был затем применен для индикации структурных изменений в флуоресцентных белках. 2. Разработана методика характеризации конформационных изменений в молекуле альбумина путем определения скорости внутримолекулярного переноса энергии электронного возбуждения. Также разработан метод контроля созревания флуоресцентных белков в клетке. 3. Развиваются оригинальные методы контроля агрегации белков под действием различных внешних факторов, локализации сайтов связывания и оценки констант комплексообразования. 4. Отработаны методики исследования микрореологических свойств крови крыс и человека в норме и при различных патологиях. Установлено, что при заболеваниях скорость образования и прочность агрегатов эритроцитов значительно выше, чем в норме. 5. Развиты методы моделирования на крысах сахарного диабета (СД) и артериальной гипертензии (АГ). Установлено, что сердечно-сосудистая система крыс приспосабливается к повышенному АД при АГ путем утолщения сосудистых стенок, что приводит к сужению просвета сосудов и повышению периферического сосудистого сопротивления. 6. Разработана двухканальная оптическая ловушка, на которой проведены предварительные измерения упругих свойств эритроцитов и сил взаимодействия между ними. 7. Разработан цифровой капилляроскоп для определения скорости кровотока в различных отделах капилляров ногтевого ложа. Для оценки степени патологического изменения капилляров предложен коэффициент ремоделирования.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 июня 2014 г.-31 декабря 2014 г. | Разработка интегральных био0оптических индикаторов патологических срстояний при социально значимых заболеваниях |
Результаты этапа: Данный проект посвящен разработке оптимального набора интегральных индикаторов, необходимого для детектирования патологических процессов в организме. Данный набор параметров должен включать оптические характеристики, измеряемые на молекулярном, клеточном и органо-тканевом уровнях. На отчетном этапе были проведены эксперименты с использованием флуоресцентной спектроскопии на модельных системах при различных внешних воздействиях, включая (i) растворы белков плазмы крови и (ii) плазму крови крыс с экспериментальным диабетом. Было показано, что полоса в спектрах флуоресценции с максимумом на 420 нм (при возбуждении в области 320 нм) может быть использована для детектирования фибриллоподобных структур, возникающих в результате нарушения конформации белков и последующей агрегации. Было предположено, что природа данной полосы связана со взаимодействием ароматических колец в агрегатах по механизму pi-stacking. Сравнительный анализ флуоресцнтных свойств тирозиновых остатках в гомологичных белках (сывороточных альбуминах) показал, что тирозиновая флуоресценция может быть в ряде случаев более чувствительной к конформационным изменениям белков, чем триптофановая флуоресценция, в частности, данный подход позволяет детектировать связывание лигандов в домены белка, расположенные на удалении от единственного триптофанового остатка в сывороточном альбумине человека. Эксперименты, проведенные на образцах плазмы крови крыс с экспериментальным диабетом, показали, что индикатором гипергликемии может служить отношение интенсивностей пиков на 390 и 450 нм в спектрах флуоресценции при возбуждении на 320 нм. Была дана интерпретация предложенного индикатора, основанная на изменении концентрация НАДФ и конечных продуктов гликирования в исследованных образцах. На отчетном этапе были также исследованы возможности формализма, основанного на уравнении Штерна-Фольмера, для определения числа сайтов связывания и констант комплексообразования в системах белок-лиганд. Был предложен подход для расчета кривых тушения флуоресценции, использующий различные модели комплексообразования в системе. Данный подход может быть использован для детектирования связывания лигандов белками плазмы крови. Оптические измерения агрегационных и деформационных характеристик эритроцитов крови крыс с экспериментально вызванными сахарным диабетом и гипертензией и их комбинацией, а также эритроцитов человеческой крови пациентов, страдающих этими же заболеваниями позволили заключить, что этихарактеристики могут рассматриваться в качестве био-оптических индикаторов этих заболеваний. При этом имеются значительные корреляции с флюоресцентно измеряемыми характеристиками белковых компонентов крови. Результаты корреляционного анализа данных капилляроскопии и кардиографицеских обследований пациентов дают основания предполагать, что повышение артериального давления вызывает ремоделирование как сердца, так и сосудов: значения систолического и диастолического артериального давления коррелировали с коэффициентом ремоделирования капиллярного русла и с индексом массы миокарда. Однако изменения микроциркуляции, по-видимому, наступают раньше, чем развивается гипертрофия миокарда левого желудочка. Таким образом, исследование показало, что перестройка капиллярного русла при артериальной гипертензии предшествует гипертрофии миокарда левого желудочка. | ||
2 | 1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г. | Разработка интегральных био0оптических индикаторов патологических срстояний при социально значимых заболеваниях |
Результаты этапа: При выполнении исследований по оптической индикации конформационных изменений белков плазмы крови были получены следующие результаты: 1) Для одного из важнейших белков плазмы крови - сывороточного альбумина человека (САЧ) были получены зависимости интенсивности тирозиновой флуоресценции от концентрации детергента SDS для различных концентраций белка. На основании совместной обработки полученных зависимостей по простейшей модели образования комплекса были определены параметры связывания (число сайтов, константа реакции образования комплекса), а также изменение сечения флуоресценции тирозина в комплексе SDS-САЧ (Приложение, таблица 1). Полученные параметры связывания согласуются с литературными данными. 2) Было проведено сравнение зависимости интенсивности тирозиновой флуоресценции от концентрации SDS для плазмы крови без патологии и водных растворов основных белков плазмы крови. На основании полученных данных можно сделать вывод, что увеличение интенсивности тирозиновой флуоресценции плазмы крови при повышении концентрации детергента обусловлено конформационными изменениями САЧ. Таким образом, в работе было показано, что 1) параметры комплекса SDS-САЧ (модель комплекса ЖК-САЧ) могут быть определены с помощью собственной флуоресценции САЧ, обусловленной наличием тирозиновых остатков в молекуле белка, в то время, как триптофановая флуоресценция практически не меняется; 2) изменение фотофизических параметров тирозина для плазмы крови при добавлении SDS полностью определяются изменением конформации САЧ. Результаты данной работы были представлены на конференциях International Conference on Advanced Laser Technologies (ALT-2015), Faro, Portugal, 7-11 Sept. 2015. и International Symposium on Optics and Biophotonics - III, Saratov, Russia, 21–25 September, 2015., а также направлены в сборник Proceedings SPIE (статья принята к публикации редактором сборника). Были измерены кинетики затухания флуоресценции молекулярного зонда, введенного в образцы плазмы крови – флуоресцентного зонда тиофлавина Т. Молекулярный зонд тиофлавин Т селективно встраивается в фибриллярные структуры, при этом его фотофизические параметры претерпевают значительные изменения. Изменения кинетик затухания флуоресцентного зонда тиофлавина Т были измерены для образцов плазмы крови крыс контрольной группы и группы с аллоксановым диабетом. Данные измерения позволили отследить корреляцию между биохимическими анализами и интегральным индикатором конформационных изменений белков плазмы крови. Также изучали микрореологические свойства эритроцитов у больных сахарным диабетом первого (СД1) и второго (СД2) типов, а также у пациентов, страдающих акромегалией. Кинетику агрегации и дезагрегации эритроцитов анализировали методом регистрации обратного светорассеяния, а деформируемость эритроцитов – методом эктацитометрии. Всего обследовано 44 человека (24 женщины и 20 мужчин): из них с СД1 - 16 человек, СД2 - 22 человека, с акромегалией – 6 человек. Диагноз клинически подтвержден, все пациенты на момент исследования находились в стационаре. У всех пациентов был значимо увеличен уровень глюкозы и гликозилированного гемоглобина. В качестве группы сравнения использовали кровь 22 практически здоровых людей, сопоставимых по полу и возрасту. Из локтевой вены всех испытуемых забиралась кровь с добавлением цитрата натрия в качестве антикоагулянта, показатель гематокрита стандартизировали – 40%. С помощью лазерного агрегометра-деформометра (LADE, RheoMedLab, Россия) оценивали способность эритроцитов образовывать агрегаты и кинетику их дезагрегации. Образование крупных агрегатов, их максимальная гидродинамическая прочность и максимальный индекс деформируемости эритроцитов были одинаковым во всех трех группах. Однако при СД2 значимо ниже оказалась внутренняя вязкость эритроцита, а жесткость мембраны выше, чем в двух других группах. В принципе, эритроциты при сахарном диабете хуже деформируются, что может влиять на движение крови в микроциркуляторном русле и приводить к микроангиопатиям. Обнаружено, что СД1 характеризуется замедленным образованием и незатрудненным распадом линейных агрегатов, но быстрым образованием трехмерных агрегатов, которые распадаются с трудом. С-пептид приводил к значимому снижению скорости образования монетных столбиков и повышению общей гидродинамической прочности агрегатов. Поскольку аналитические возможности клинических исследований ограничены, экспериментально воспроизводили на крысах модели социально значимых заболеваний, таких как ишемический инсульт и сахарный диабет. Микрогемореологические параметры изучались при экспериментальной фокальной ишемии головного мозга, развивающейся вследствие окклюзии (ОСМА), или тромбоэмболии средней мозговой артерии (ТЭСМА) у крыс путем введения аутологичного, заранее приготовленного тромба. При отсутствии существенных изменений деформируемости эритроцитов, наблюдалось некоторое ускорение образования их агрегатов. Прочность эритроцитарных агрегатов изменялась разнонаправленно – в модели с ОСМА она повышалась, а при ТЭСМА – снижалась. Таким образом, механизм инициации ишемии играет существенную роль в направлении гемореологических изменений. Результаты данной работы были представлены на конференции International Conference on Advanced Laser Technologies (ALT-2015), Faro, Portugal, 7-11 Sept. 2015.. Проведенные исследования выявили значимые различия в микроциркуляторной картине между группами пациентов с компенсированным и декомпенсированным СД, а также при сравнении с контрольной группой. Для изучения взаимосвязи нарушения реологических свойств крови in vivo и параметров агрегации клеток крови in vitro все пациенты были разделены на 2 группы: c нормальной агрегацией эритроцитов (n = 15) и с повышенной агрегацией эритроцитов (n = 10) по капилляроскопии. значимые различия между группами обнаружены по параметрам агрегации эритроцитов « t1/2» и «критическое время» (t1/2) и агрегации тромбоцитов. При проведении капилляроскопии выявлено близкое к значимому снижение средней скорости капиллярного кровотока у пациентов с артериальной гипертензией, получающих гипотензивную терапию, и не принимающих кардиомагнил. Значимых различий по параметрам агрегации эритроцитов при исследовании прибором «Rheoscan-A» выявлено не было. Агрегация тромбоцитов по Борну не была нарушена. Значимые различия между группами с нормальной и повышенной агрегацией эритроцитов обнаружены для « t1/2» и «критическое время», (t1/2) и агрегации тромбоцитов. Результаты данной работы были представлены на конференциях: 3rd International Conference «BioPhotonics-2015», Florence, Italy, 20-22 May 2015 и SFM’15 и International Symposium on Optics and Biophotonics - III, Saratov, Russia, 21–25 September, 2015. | ||
3 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Разработка интегральных био0оптических индикаторов патологических срстояний при социально значимых заболеваниях |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".